Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 6 )

3.1.2 Приложение экспериментально-расчетного метода для определения глубины иммобилизации КЭ в ЦАФ

Получение полимерных матриц с иммобилизованными в них КЭ требует информации о характере этого процесса в зависимости от выбранной технологии получения ХМ. В частности, важной информацией является глубина вещественной иммобилизации в матричное окружение. Это связано с задачей получения ультратонких пленок или рабочей хемосенсорной зоны, поскольку, чем больше эта зона, тем больше время, идущее на вещественный массоперенос раствора определяемой соли в хемосенсорный материал (ХМ). Поэтому необходимо минимизировать такую область в рамках технологии получения ХМ. Для этого требуется получать ультратонкие пленки, толщина которых исчисляема в пределах сотен нанометров, или получить рабочую область в этих пределах. В процессе получения ХМ на твердых подложках методом полива была установлена невозможность получения подобных ультратонких пленок (метод достоверно позволяет получать пленки в пределах 10-15 мкм). Однако реализовать рабочую область в пределах сотни нанометров представляется возможным посредством модифицированной методики полива. Для реализации подобной задачи, а также для решения ряда других важнейших задач работы был разработан экспериментально-расчетный метод (ЭРМ).

Данный экспериментально-расчетный метод (ЭРМ) основан на модифицированной методике полива пленок и идее послойного нанесения компонентов ХМ. Его цель – количественно, посредством выведенных формул, описать картину вещественной иммобилизации в матричное окружение. Перспективность данного метода состоит также в том, что он может стать фундаментом для разработок технологии управляемой вещественной иммобилизации.

Рассмотрим универсальный процесс послойного нанесения компонентов ХМ в частном случае модифицированной методики полива пленок. Первый этап – полив полимерной матрицы без КЭ. Известно, что данный полимер растворяется в определенных растворителях, при этом скорость растворения в различных растворителях неодинакова. Процесс формирования полимерной пленки из раствора во многом определяется скоростью испарения растворителя данного полимера. Второй этап – нанесение на сформированную пленку раствора КЭ в соответствующем растворителе. При этом растворитель может быть идентичен тому, в котором был растворен полимер, а может быть представлен иным растворителем, в котором данный полимер может растворяться или не растворяться. У данного растворителя также своя скорость испарения, которая, в свою очередь, во многом определяет кинетику иммобилизации КЭ (и не только КЭ) в полимерное окружение. Проведенные многочисленные опыты на основе модифицированной методики полива пленок свидетельствуют, что процесс вещественной иммобилизации определяется по существу двумя параметрами – скоростью растворения полимера данным растворителем и скоростью испарения растворителя. Для количественной оценки толщины активной зоны, т. е. зоны полимерной матрицы, где наблюдается преимущественное концентрирование иммобилизованного вещества, требуется предложить математические формулы, учитывающие эти два параметра. В этом и заключается смысловое содержание экспериментально-расчетного метода – ЭРМ.

Известна следующая формула:

ω=m/(m+ρV0),

где ω – массовая доля растворенного вещества, m – масса растворенного вещества (г), ρ – плотность растворителя (г/мл), V0 – объем растворителя (мл). При учете двух ведущих процессов пленкообразования и вещественной иммобилизации – скорости растворения вещества в растворителе и скорости испарения растворителя – получаем в общем виде две функции. Будем считать, что скорость растворения полимера (или любого вещества) – это функция отношения бесконечно малого приращения массовой доли к бесконечно малому приращению времени, а также существует обратная скорости функция отношения бесконечно малого приращения времени к бесконечно малому приращению массовой доли: dω/dt=v(t) и dt/dω=r(ω).

Соответственно: ω= ∫v(t)dt=H(t) и t=∫r(ω)dω=R(ω)

Аналогичное рассуждение выстраивается и при выводе общей формулы скорости испарения растворителя. В данном случае под скоростью испарения будем считать функцию отношения бесконечно малого приращения объема растворителя к бесконечно малому приращению времени: dV/dt=f(t)

Тогда V=∫f(t)dt=F(t). Поскольку послойное вещественное нанесение связано с одновременной реализацией двух процессов – растворения полимера в растворителе и испарения растворителя, то получаем общую формулу ЭРМ:

ω=m/(m+ρ(V0-F(R(ω))

Далее для определения глубины проникновения иммобилизованного вещества в полимер воспользуемся соотношением значения массы из данной формулы с массой общего полимера на пленку с заданной толщиной следующим образом:

m/m0=h/h0

где m0 - масса пленки, h0 – толщина пленки, m – масса полимера, растворенного в растворе КЭ, h – искомая толщина.

Таким образом, толщина активной зоны полностью должна определяться соотношением скоростей растворения полимера и испарением данного растворителя, а не количеством сформированного полимера на кварцевой подложке. На основе общей теории ЭРМ формулируются основные экспериментальные подходы для получения требуемых эмпирических параметров, а также выстраивается методология по организации и постановке соответствующих экспериментов. В общем виде они могут быть представлены следующим образом:

1.  Экспериментальное определение кинетики растворения полимера в соответствующем растворителе.

2.  Экспериментальное определение кинетики испарения растворителя для системы полимер - растворитель.

3.  Нахождение функции скорости растворения полимера в соответствующем растворителе в интегральном виде.

4.  Нахождение функции скорости испарения растворителя в интегральном виде.

5.  Определение зависимости интегральной функции скорости испарения от массовой доли раствора полимера для соответствующего растворителя.

6.  Нахождение глубины проникновения раствора КЭ в толщину сформированной пленки при изготовлении ХМ по модифицированной методике полива пленок.

Отталкиваясь от общих рассуждений и выводов ЭРМ, удалось экспериментально вывести эмпирическую формулу для системы ЦАФ в ацетоне.

Постановка экспериментов:

·  Определение времени полного растворения ЦАФ в ацетоне при приготовлении 4% раствора. Оно составило 54 минуты.

·  Определение оптимального экспериментального значения массы ЦАФ при приготовлении 4% раствора ЦАФ в ацетоне. Оно составило 0,4г. на 12,3мл ацетона.

·  Определение экспериментально-незначительных массовых изменений при получении растворов ЦАФ, близких к 4% в ацетоне. Такими массами являются 0,01 г, 0,02 г, 0.03 г.

·  Взятие для приготовления раствора ЦАФ в ацетоне полимера с незначительным изменением массы от 0,4 г в указанных пределах (в граммах): 0,39, 0,41, 0,42, 0,43. Измерение времени полного растворения полимера в растворителе. Это время составляло: 47 минут, 60 минут, 65 минут и 70 минут соответственно.

·  Проверка воспроизводимости полученных результатов.

·  Анализ полученных данных и поиск эмпирической формулы функции скорости. Эта функция соответствовала в дифференциальном виде следующей: dω%/dt=1/t. При интегрировании этого уравнения получаем: ω%= ∫dt/t=lnt+C. При С=0 получаем: ω%= lnt или t=eω%.

·  Экспериментальная проверка предложенной эмпирической формулы. Извлекаем известную массу ЦАФ и приготавливаем раствор с известной массовой долей, например 5% раствор ЦАФ в ацетоне. Рассчитываем по формуле теоретически ожидаемую величину, при этом измеряем время полного растворения полимера. Теоретически ожидаемое время растворения полимера составляло 146,2 минуты, что примерно равно 2,4 часа. Экспериментальное время растворения составляло 2 часа 30 минут. Для 10%-ного раствора теоретическое время составило 21365 минут. Экспериментально полное растворение ЦАФ в ацетоне обнаружено на пятнадцатые сутки, что согласуется с прогнозом.

·  Определение скорости испарения растворителя. В данном случае растворителем является ацетон. В нем растворяется как ЦАФ, так и КЭ. В процессе экспериментальных исследований было установлено, что его скорость испарения математически выражается как прямая пропорциональность при фиксированной площади поверхности стандартных пленок (3 см2): V=10-2t (объем - в мл, а время - в минутах).

·  Подставляем полученные формулы для ЦАФ в ацетоне в общую формулу ЭРМ. Получаем: ω= m:(m+ρ(V0 -10-2eω% )), где ω – массовая доля полимера, m – масса полимера, растворенного раствором КЭ, ω% - массовая доля полимера, выраженная в процентах, ρ – плотность растворителя (г/мл), V0 – начальный объем раствора КЭ (мл).

·  В соответствии с формулой для ЦАФ в ацетоне становится ясно, что увеличение массовой доли полимера в условно образующемся временном растворе определяется кинетикой растворения полимера и скоростью испарения растворителя, которая на соответственном этапе будет определять увеличение массовой доли, а скоростью растворения полимера можно будет пренебречь.

·  В соответствии с формулами была определена толщина активной зоны ХМ, которая для ЦАФ в ацетоне составляет примерно 1,45мкм.

Таким образом, использование модельных исследований в разработке ХМ на основе КЭ оказалось перспективным. Их активное применение в данной работе привело к решению ряда важнейших вопросов и формированию эффективного экспериментально-исследовательского аппарата.

3.2 Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами

Была исследована возможность определения ряда аминокислот в водных растворах с помощью КЭ №5, иммобилизованного в матрицу на основе ЦАФ. В качестве аминокислот применяли глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин и изолейцин. Также исследовались монослои КЭ №5 с лизином (в присутствии стеариновой кислоты).

Полученные результаты приведены ниже на графиках и в таблицах, а также в приложении.

Исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №5 до и после воздействия водного раствора соответствующей аминокислоты с концентрацией 10-3 М в области 300-700 нм. Как следует из литературных данных, об образовании супрамолекулярных комплексов краун-эфира и катиона металла (комплексы типа «гость-хозяин») судят по сдвигу ∆λ максимума длины волны поглощения и/или флуоресценции. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ. Снимали спектры поглощения и флуоресценции с полученных ХМ на основе КЭ №5, иммобилизованного в ЦАФ, до и после контакта с водными растворами выше указанных аминокислот при их концентрации 10-3 М. Поскольку сдвиги максимумов длины волны на спектрах флуоресценции были выражены сильнее, далее в графическом выражении приводятся именно спектры флуоресценции.

Рисунок 3.2.1 Спектр флуоресценции КЭ№ 5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе аланина с концентрацией 10-3 моль/л

Рисунок 3.2.2 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе фенилаланина с концентрацией 10-3 М.

Рисунок 3.2.3 Спектр флуоресценции КЭ - 5 в ЦАФ до (1) и после (2) контакта с раствором серина (конц. 10-3 М)

Рисунок 3.2.4 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе аргинина с концентрацией 10-3 моль/л

Рисунок 3.2.5 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе изолейцина с концентрацией 10-3 моль/л

Рисунок 3.2.6 Спектр флуоресценции КЭ №5 в пленке ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе глицина с концентрацией 10-3 моль/л.

Данные из спектров флуоресценции ХМ, содержащих КЭ №5, до и после взаимодействия с аминокислотами, приведены в таблице 3.2.1.

Таблица 3.2.1 Флуоресценция полимерных пленок на основе ЦАФ, содержащих КЭ № 5, до и после выдерживания в водных растворах аминокислот с концентрацией 1 мМ.

Аминокислота	l, нм, (до пропитки)	l, нм, (после пропитки)	сдвиг Dl, нм
глицин	512±1	520±1	+8
фенилаланин	512±1	524±1	+12
аланин	512±1	517±1	+5
серин	512±1	520±1	+8
аргинин	512±1	521±1	+9
изолейцин	512±1	519±1	+7

Видно, что после воздействия на полимерную матрицу ЦАФ с КЭ №5 водными растворами аминокислот в спектрах наблюдаются следующие сдвиги длины волны максимума флуоресценции: для раствора фенилаланина он составляет 12 нм, аргинина - 9 нм, для глицина и серина - 8 нм, изолейцина - 7 нм и аланина - 5 нм. На основе полученных результатов наибольший сдвиг наблюдается для раствора фенилаланина по сравнению с остальными растворами, что может быть интерпретировано как селективная хемосенсорная активность полученной ХМ для определенной аминокислоты.

Эти данные свидетельствуют о возможном использовании ХМ на основе ЦАФ и КЭ № 5 для возможной детекции аминокислот.

Для получения наноразмерных пленок была использована альтернативная технология (Лэнгмюра). Этой технологией были получены монослои КЭ №5 со стеариновой кислотой (мольное соотношение 1:2) в присутствии и в отсутствие водного раствора лизина (концентрации лизина 1 мМ). Были построены изотермы поверхностного давления и поверхностного потенциала полученных монослоев (рис. 3.2.7), а также проведены спектральные исследования данных монослоев до и после контакта с раствором лизина при концентрации 1 мМ (табл. 3.2.2.).

Рисунок 3.2.7 Изотермы поверхностного давления (1;3) и поверхностного потенциала (2;4) для смеси КЭ №5(1мМ):C18(1мМ)=1:2 на субфазе 1мМ водного раствора лизина Таблица 3.2.2 Спектр флуоресценции монослоя смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты (С18) в соотношении КЭ №5:С18=1:2 без контакта и с контактом водного раствора лизина с концентрацией 1 мМ
	Монослой	l, нм, (нет контакта)	l, нм, (есть контакт)	Dl, сдвиг нм
	Смеси КЭ №5:С18=1:2	534±1	536±1	+2

Спектр флуоресценции монослоя смеси КЭ №5:С18=1:2 показал батохромный сдвиг +2 нм, что не является достоверным доказательством процесса комплексообразования КЭ №5 с лизином при исследованной концентрации последнего.

3.3 Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция

Была изучена возможность определения ионов Са2+ в водных растворах с помощью КЭ №6, иммобилизованного в матрицу на основе ЦАФ и ЦА. Полученные результаты приведены ниже на графиках и в таблицах.

Исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 до и после воздействия «аналита» (водные растворы перхлората кальция с концентрацией 10-4 М) в области 300-700 нм. Как следует из литературных данных, об образовании супрамолекулярных комплексов краун-эфира и катиона металла (комплексы типа «гость-хозяин») судят по сдвигу ∆λ максимума поглощения и флуоресценции, а также по изменению их интенсивности. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ.

Рисунок 3.3.1 Спектр поглощения КЭ №6в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц 10-4 М

Рисунок 3.3.2 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-4 М

Из рисунков видно, что интенсивность поглощения увеличивается от 0,187 до 0,446. Наблюдается гашение флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция с конц. 10-4 М снижается от 8328 до 6545, а пик максимума флуоресценции сдвигается в длинноволновую область от λ=630 нм до λ=649 нм (∆λ=19 нм).

Далее, исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 при концентрации 10-3 М. Полимер ЦАФ.

Рисунок 3.3.3 Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-3 М

Рисунок 3.3.4 Спектр флуоресценции КЭ №6в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-3М

В этом случае интенсивность поглощения увеличивается от 0,100 до 0,221. Интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция разгорается от 523 до 627, и наблюдается сдвиг в длинноволновую область от λ=610 нм до λ=632 нм (∆λ=22 нм).

Далее, исследовались спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 при концентрации 10-2 М. В качестве полимерной матрицы использовали ЦАФ.

Рисунок 3.3.5 Спектр поглощения КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-2 М

Рисунок 3.3.6 Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (1) и после (2) выдерживания в растворе перхлората кальция с конц. 10-2 М

Из рис. 3.3.5 видно, что интенсивность поглощения увеличивается от 0,099 до 0,240. Наблюдается разгорание флуоресценции, интенсивность пиков флуоресценции в присутствии катионов кальция увеличивается от 8359 до 11803 (рис. 3.3.6), а пик максимума флуоресценции сдвигается в длинноволновую область от λ=630 нм до λ=649 нм (∆λ=19 нм).

Поскольку в биологических жидкостях организма присутствуют ионы натрия в высоких концентрациях, были исследованы спектры поглощения и флуоресценции КЭ №6 в присутствии катионов кальция и натрия. Концентрация обоих ионов составляла 10-2 М. В качестве полимера использовали ЦАФ. Результаты эксперимента приведены на рисунках и в таблицах.