Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 8 )

В процессе дальнейшей работы были широко использованы методы МКД на различных средах с целью получения ХМ на основе КЭ. Так, в качестве матрицы для ХМ были выбраны полимерные пленки и гели. В качестве полимерных пленок были использованы ПВБ и ЦАГФ, а в качестве геля – желатин. Серия экспериментов по выбору и изучению перспективных матриц для ХМ свелась к тому, что на основе технологии пленкоформирования на жидкой подложке в пробирке удалось сформировать пленки в методе МКД, где р2 являлась пленка толщиной 10 мкм. Также по аналогии с этими пленками, сформированными в пробирке, был использован желатин с водой в соотношении 1:1. Толщина геля в качестве р2 примерно 0,8 – 1 мм. После пятидневного выдерживания пленок в МКД не обнаружено изменения содержания катионов кальция в р3. Такой же эффект был обнаружен при выдерживании желатина в МКД, но при этом было зафиксировано увеличение толщины геля примерно на 80%.

Впоследствии на желатиновом геле были разработаны и поставлены следующие эксперименты. Так, была использована система желатин:вода 1:1 и 1:10. 5 г сформированного геля добавляли в различные жидкости объемом 10 мл. При этом испарение исключалось. В качестве жидкостей использовалась вода, раствор перхлората кальция с концентрацией 60 мМ. Вначале были исследованы гели с соотношением 1:1: к 5 г геля добавляли 10 мл воды, и систему выдерживали сутки. Через сутки вода сливалась и повторно взвешивалась. При этом наблюдалось уменьшение массы воды на% (т. е. масса повторного взвешивания составляла 9 - 8,9г). Такой же опыт был проведен с системой 1:10. В этом случае изменение массы воды после суточного выдерживания составило 1,5 – 2 % от массы.

Аналогичная серия опытов была поставлена с раствором хлорида кальция с концентрацией 60 мМ. Результаты взвешивания раствора хлорида кальция после суточного отстаивания с системой 1:1 также показали уменьшение массы раствора на 10-12%. После титрования раствора хлорида кальция было обнаружено незначительное изменение концентрации ионов Са2+ на 2,0-2,5%. Поставленные опыты с раствором хлорида кальция для системы 1:10 показали на тот же процент изменения массы раствора (1,5 - 2,0 %) и отсутствие изменения концентрации ионов Са2+ после суточного выдерживания. По результатам этих экспериментов для исследований была выбрана система 1:1.

На ее основе были поставлены следующие эксперименты: введение в желатин (в относительно теплый раствор, не успевший затвердеть) соли хлорида кальция с концентрацией в полученном растворе 60 мМ (условное обозначение первой системы – «желатин+Са»). Для другой системы в желатин вводился КЭ №1 с концентрацией 0,1 М. (условное обозначение второй системы – «желатин+КЭ №1»). К первой системе («желатин+Са») была добавлена вода (в соотношении 10 мл воды на 5 г системы). Ко второй системе («желатин+КЭ №1») был добавлен раствор хлорида кальция с концентрацией 60 мМ. Для системы «желатин+Са» масса воды была повторно взвешена и протитрована; по результатам взвешивания масса воды уменьшилась на 18-20%, а концентрация катионов Са2+ в воде титриметрически обнаружена не была. Для системы «желатин+КЭ №1» масса раствора уменьшилась на 22-25%, а концентрация катионов Са2+, обнаруженная титриметрически, составила значение 49 мМ. При этом по количеству вещества КЭ №1 был в избытке по сравнению с катионами Са2+ в растворе.

Для системы «желатин+КЭ №1» был поставлен опыт с заменой раствора хлорида кальция на воду. В результате масса воды также уменьшалась на 22-25%. На основании данных экспериментов было предложено совместное использование двух краун-эфиров в геле в таком количестве, чтобы одного из них (КЭ №1) было в 100 раз больше другого (КЭ №3). Была изготовлена система «желатин:вода» в массовом соотношении 1:1, с концентрацией КЭ №1 100 мМ и концентрацией КЭ №3 1 мМ. Данная система была приведена в контакт с раствором хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. После этого окраска системы изменилась от оранжево-красной до желто-зеленой. На рисунке 3.4.1 представлены фотографии полученных желатиновых систем.

а) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ

 

б) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ после контакта с раствором хлорида кальция c концентрацией 60 мМ.

в) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сверху.

г) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сбоку.

Рисунок 3.4.1 Желатиновые системы до и после контакта с растворами хлорида кальция с концентрациями 60 мМ и 5 мМ: а) Система желатин-КЭ №3 при концентрации 1 мМ; б) Система: желатин-КЭ №3 при концентрации 1мМ после контакта с раствором хлорида кальция c концентрацией 60 мМ; в) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сверху; г) Желатиновая пленка состава: желатин+КЭ №1+КЭ №3, где отношение КЭ №1:КЭ №3=100:1. Вид сбоку

Полученные результаты коррелируют с результатами Громова и сотр. по исследованию комплексообразования производного краун-эфиров с катионами металлов [1,2] и свидетельствуют о перспективности использования данной системы и общего методологического подхода использования гелей в получении хемосенсорных нанокомпозитных материалов.

Таким образом, проведенные исследования показали следующее:

1.  Разработана эффективная методика исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция с использованием различных растворителей, названная авторами «методом контролируемой диффузии».

2.  Посредством данной методики были изучены особенности процесса комплексообразования некоторых производных краун-эфиров с катионами кальция.

3.  Предложена новая рецептура получения сенсорных материалов на основе двух типов краун-эфиров, иммобилизованных в пленку из желатина.

4.  МКД позволяет не только проводить исследования молекулярного поведения в системе растворов, но и является основой для подтверждения достоверности интерпретации получаемых в процессе исследования фактических результатов.

3.5 Исследование комплексообразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция

Были изготовлены пленки с расчетной толщиной 50 мкм. Состав пленок: желатин, КЭ №3, КЭ №1. Мольное отношение КЭ №3:КЭ №1 = 1:100. Они были приведены в контакт:

1)  с дистиллированной водой;

2)  с растворами хлорида кальция с концентрациями 1, 2, 5 мМ;

3)  с растворами хлорида кальция и натрия с концентрациями 5 и 150 мМ, соответственно, а также 5 и 50 мМ, соответственно.

После этого полученные ХМ были подвергнуты спектроскопическим исследованиям (снятие спектров поглощения и спектров флуоресценции), результаты которых представлены на рис. 3.5.1 – 3.5.5.

Рисунок 3.5.1 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в воде

Рисунок 3.5.2 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 1 мМ

Рисунок 3.5.3 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 2 мМ

Рисунок 3.5.4 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ

Рисунок 3.5.5 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ.

Рисунок 3.5.6 Спектр поглощения КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ и хлорида натрия с концентрацией 150 мМ

Рисунок 3.5.7 Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (1) и после (2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ и хлорида натрия с концентрацией 50 мМ

Из графиков спектров поглощения видно, что для КЭ №3, иммобилизованного в желатиновой системе в присутствии КЭ №1 в отношении к КЭ №3 = 100:1 в присутствии одновременно двух солей (хлоридов натрия и кальция в соотношении 100:1 соответственно) наблюдается гипсохромный сдвиг (Δλmax = -5 нм). В присутствии хлорида кальция при концентрации 2 мМ наблюдается незначительный гипсохромный сдвиг (Δλmax = -3 нм), который можно расценивать в пределах ошибки эксперимента. В присутствии хлорида кальция при концентрации 1 мМ наблюдается незначительный сдвиг максимума поглощения в батохромную область (Δλmax = +8 нм), что указывает на возможное проявление сольватохромного эффекта. В присутствии хлорида кальция при концентрации 5 мМ наблюдается выраженный сдвиг максимума поглощения в гипсохромную область (Δλmax = -39 нм), что указывает на образование комплекса между КЭ №3 и кальцием. В таблице 3.5.1 приведены результаты спектров поглощения для желатиновых пленок с иммобилизованным КЭ №3.

Таблица 3.5.1 Положение максимума поглощения для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 в различных водных растворах

Желатиновая пленка на основе КЭ №3/КЭ №1=1:100	l, нм, (до пропитки)	l, нм, (после пропитки)	сдвиг Dl, нм
Р-р CaCl2 1 мМ	444	452	+8
Р-р CaCl2 и NaCl 5 и 150 мМ соот.	445	440	-5
Р-р CaCl2 2 мМ	447	444	-3
Р-р CaCl2 5 мМ	443	404	-39

Из графиков спектров флуоресценции видно, что для КЭ №3, иммобилизованного в желатиновой системе в присутствии КЭ №1 в отношении к КЭ №3 = 100:1 в присутствии воды наблюдается батохромный сдвиг флуоресценции (Δλmax = +9 нм). В присутствии одновременно двух солей (хлоридов натрия и кальция в соотношении 10:1 соответственно) наблюдается гипсохромный сдвиг (Δλmax = -9 нм). В присутствии хлорида кальция при концентрации 5 мМ наблюдается выраженный сдвиг максимума флуоресценции в гипсохромную область (Δλmax = -103 нм), что указывает на образование комплекса между КЭ №3 и кальцием. В таблице 3.5.2 приведены результаты спектров флуоресценции для желатиновых пленок с иммобилизованным КЭ №3.

Таблица 3.5.2 Положение максимума флуоресценции для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 в различных водных растворах

Желатиновая пленка на основе КЭ №3/КЭ №1=1:100	l, нм, (до пропитки)	l, нм, (после пропитки)	сдвиг Dl, нм
Вода	609	618	+9
Р-р CaCl2 и NaCl 5 и 50 мМ соот.	605	596	-9
Р-р CaCl2 2 мМ	607	504	-103

Также был снят спектр флуоресценции с контрольной желатиновой пленки, в которую иммобилизовали не КЭ №3, а его заранее приготовленный комплекс с кальцием, обозначенный как [КЭ №3+Са].

Рисунок 3.5.8 Спектр флуоресценции желатиновой пленки с иммобилизованным готовым комплексом КЭ №3 и кальция – [КЭ №3+Са]

Из графика спектра флуоресценции (рис.3.5.8) видно, что для готового комплекса [КЭ №3+Са], иммобилизованного в желатиновую систему, максимум флуоресценции соответствует 503 нм, что примерно равно значению максимума флуоресценции для желатиновой пленки с сопряженными краун-эфирами на основе КЭ №3 после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ. В таблице 3.5.3 приведены результаты максимумов флуоресценции для КЭ №3 в растворе (растворитель - ацетонитрил), в желатиновой пленке с иммобилизованным [КЭ №3+Са] и желатиновая пленка на основе сопряженных кран-эфиров.

Таблица 3.5.3 Положение максимума флуоресценции для желатиновых пленок на основе КЭ №3 в сочетании с КЭ №1 в отношении КЭ №3/КЭ №1 1:100 при контакте с раствором хлорида кальция 5 мМ; желатиновой пленки с иммобилизованным готовым комплексом [КЭ №3+Са], а также для КЭ №3 в растворе (растворитель – ацетонитрил)

Система	l, нм, (до пропитки)	l, нм, (после пропитки)	сдвиг Dl, нм
Желатин+ [КЭ №3+Са]	503	-	-
Желатин КЭ №3/КЭ №1 1:100	607	504	-103
КЭ №3 в ацетонитриле	660	555	-105

Из таблицы видно, что сдвиг максимума флуоресценции для раствора КЭ №3 после добавления к нему перхлората Са составляет -105 нм, что практически совпадает с величиной сдвига максимума флуоресценции для желатиновой пленки КЭ №3/КЭ №1 1:100, после контакта с раствором хлорида Са и составляет -103 нм. При этом значения максимума флуоресценции для этой пленки практически совпадают со значением максимума флуоресценции для желатиновой пленки с иммобилизованным комплексом [КЭ №3+Са] (504 нм и 503 нм соответственно). Полученные результаты указывают на достоверность комплексообразования КЭ №3 в желатиновой системе КЭ №3/КЭ №1= 1:100 с катионом кальция в водном растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ.

К графикам спектров поглощения и флуоресценции прилагается фотография желатиновой пленки КЭ №3/КЭ №1 = 1:100 до и после замачивания (оранжевого цвета до и желто-зеленного после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ).

Рисунок 3.5.9 Фотография желатиновой пленки с системой

КЭ №3/КЭ №1=1:100 до и после замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ (до замачивания - оранжевого цвета, после - желто-зеленого цвета).

Выводы

1. Разработаны методики, получены и исследованы хемосенсорные материалы на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включенными биоорганическими соединениями типа азакраун-эфирных производных стириловых красителей, для детекции катионов кальция и аминокислот в биологических жидкостях. Изучены оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах, установлено влияние матрицы на сдвиги максимумов спектров поглощения и флуоресценции. Оптимизированы методы получения и свойства хемосенсорных материалов.

2. Установлено, что при комплексообразовании соединения №5 с рядом аминокислот (с концентрацией 1 мМ) в пленках целлюлозы ацетатфталата наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в присутствии раствора аланина в длинноволновую область на 5 нм, изолейцина — на 7 нм, глицина и серина – на 8 нм, аргинина — на 9 нм, фенилаланина – на 12 нм, что перспективно для детекции аминокислот.

3. Разработан экспериментально-расчетный метод и методика исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция с использованием различных растворителей, названная «методом контролируемой диффузии». Посредством этого метода установлен первый концентрационный порог для определения катионов кальция с помощью исследованных производных краун-эфиров, равный 50 мМ.

4.  Впервые получены наноструктурированные хемосенсорные материалы на основе желатина и иммобилизованных в него производного азакраун-эфира №4 и бензо-18-краун-6-эфира в массовом соотношении 1:100, что позволило регулировать молекулярные механизмы комплексообразования. Указанные бионанотехнологические решения позволили достичь в желатиновых матрицах сдвига флуоресценции на 103 нм в гипсохромную область для концентрации катионов кальция в водном растворе 5 мМ.

5.  Получены монослои и краун-содержащие композитные материалы с основой из биополимерной матрицы, и показана перспективность последних для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля в биологических жидкостях катионов кальция и аминокислот.

Практические предложения

По материалам исследования разработаны: «Технологическая инструкция по изготовлению хемосеносрных бионанотехнологических пленок на основе желатина и иммобилизованного КЭ-3 для детекции катионов кальция», утвержденная ВНИТИБП РАСХН (21.10.2010г.); «Методика получения и характеристики лабораторных образцов бионанотехнологических материалов для сенсорных устройств», утвержденная научно-методическим советом ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол от 01.01.2001).

Основные результаты диссертации используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии», и в рамках НОЦ ФГОУ ВПО МГАВМиБ (ГК 02.740.11.0270 и ГК 02.740.11.0718).

Список литературы

1. Алыкова, мониторинг объектов окружающей среды/ . - Астрахань: Астрах. гос. пед. ун-т, 20с.

2. Грицкова, свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка / , , // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника / Москва. – 2005. – Вып. 1-2. – С. 69-75.

3. Грицкова, И. А. The effect of the conditions of the chemical reaction of ionic surfactant formation at the interface on the dispersity of emulsions and polymer suspensions / , // Коллоидн. журнал – 1999. – Т. 61. № 2. – С. 264-270.

4. Громов, органическая фотохимия краунсодержащих стериловых красителей / , // Известия Академии наук. Серия химическая. – 1997. – №4. – С.641-665.

5. Гуль, -химические основы производства полимерных плёнок / , – М.: Наука, 1978. – 279 с.

6. Давыдова, макроциклы / – Л.: Химия, 1989. – 306 с.

Дугов, аналитическая химия. / . - М., 20с.

8. Егоров, сульфатселективный электрод и его применение в анализе / , , // Журнал аналитической химии / Академиздатцентр "Наука" РАН. – 2006. – Т. 61. – С. 416-432.

9. Ермаков, экология животных. / , . - М.: Наука, 20с.