Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 1 )

Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины
и биотехнологии имени »

На правах рукописи

Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров

03.01.04-биохимия

03.01.06-биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, доктор химических наук, профессор

,
доктор химических наук,
профессор

Москва – 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ…………………………….4

ВВЕДЕНИЕ………………… ……………………………………...….………….5

ГЛАВА 1. Обзор литературы…….……………………………………………..11

1.1. Строение и химические свойства краун-эфиров в качестве синтетических аналогов природных макроциклов……………………………….………….…15

1.2. Получение краун-эфиров…………………………………………………...21

1.3. Супрамолекулярная органическая фотохимия краунсодержащих стириловых красителей………………………………………………………...25

1.4. Строение краунсодержащих стириловых красителей…………...............26

1.5. Электронные спектры, темновое и фотоиндуцированное комплексообразование краунсодержащих стириловых красителей…………28

1.6. Полимерные пленки, содержащие производные краун-эфиров………. 37

1.7. Методы определения ионов кальция……………………………………....40

1.8. Создание системы очувствления ВМР для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта……………………………………………………..43

ГЛАВА 2. Материалы и методы ………..……………………………………...45

2.1. Перечень используемых реактивов …………………………..…….……..45

2.2. Перечень используемой посуды и вспомогательных устройств………...47

2.3. Методики, применявшиеся в работе………………………………………47

2.3.1. Приготовление растворов полимеров…………………………………...47

2.3.2. Приготовление растворов краун-эфиров………………………………..50

2.3.3. Проверка совместимости растворов полимера и краун-эфира…….…..50

2.3.4. Приготовление растворов солей…………………………………………51

2.3.5. Приготовление совместных растворов полимеров и краун-эфиров

для отлива пленок…………………………………………………………..........51

2.3.6. Получение полимерных пленок……………………………………….....51

2.3.7. Определение концентрации катионов кальция в водном растворе посредством хелатометрического титрования………………………………...53

2.3.8. Получение монослоев смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты…..……..54

2.3.9. Методика измерения спектров поглощения……………………….…....54

2.3.10. Методика измерения спектров флуоресценции ……………………....58

2.3.11. Методика построения графиков в "OriginPro70"……………………...62

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение………..63

3.1 Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода………………………………………….65

3.1.1 Сущность модифицированной методики ………………………………..66

3.1.2 Приложение экспериментально-расчетного метода для определения глубины иммобилизации КЭ в ЦАФ…………………………..........................68

3.2 Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами ...........................................74

3.3. Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция...................................................................................................................80

3.4 Разработка метода контролируемой диффузии для изучения процессов комплексообразования КЭ с катионом кальция……………………………….94

3.4.1 Результаты и обсуждения по титриметрическому анализу………….…94

3.4.2 Сущность метода контролируемой диффузии……………......................96

3.5. Исследование комплексобразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция ……………………………….102

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….111

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………….……………..113

ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………………………...124

Условные обозначения и сокращения

ХМ хемосенсорные материалы

ПВБ поливинилбутираль

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПВХ поливинилхлорид

МКД метод контролируемой диффузии

ЭРМ экспериментально-расчетный метод

КЭ краун-эфиры

КЭ №1 бензо-18-краун-6

ПС полистирол

ЦАБ целлюлозы ацетатбутират

ЦАГФ целлюлозы ацетатгидрофталат

l длина волны поглощения или флуоресценции

lmax максимум длины волны поглощения или флуоресценции

I интенсивность поглощения или флуоресценции

Ед единицы интенсивности

(∆m/m0) влагопоглощение

нм нанометры

мкм микрометры

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Последние десятилетия отмечены заметно возросшим интересом к наукам и технологиям, связанным с жизнедеятельностью человека и других живых организмов – медицине, биотехнологии, микробиологии и других. В том числе это относится к созданию и исследованию материалов, предназначенных для использования в этих областях. Круг таких материалов достаточно широк. Однако наиболее широкие возможности связаны с различными полимерами и композитами на их основе.

К основным направлениям использования полимеров в медико-биологических областях, помимо материалов, применяемых в замене (замещении) органов и тканей и других методах лечения, относятся материалы для биоинженерных методов и материалы для биоанализа.

В разных случаях к используемому материалу предъявляются различные требования, определяемые условиями его функционирования, поэтому нельзя выделить какой-то один материал, пригодный для применения во всех случаях. При этом может быть отмечен ряд общих требований, относящихся ко всем объектам, вводимым в организм: они не должны после введения в организм выделять вредные вещества, то есть должны обладать биологической инертностью (не оказывать биологического действия на окружающие ткани и организм в целом и, в свою очередь, быть устойчивыми к их воздействию); должны выдерживать условия стерилизации стандартными методами; должны изготавливаться из пригодных материалов по достаточно простой технологии.

В принципе, самый безвредный материал только условно может быть отнесен к биоинертным материалам, поскольку уже сам факт введения постороннего объекта в организм в любом случае вызывает некую ответную реакцию организма.

Более точно характеризует благоприятную ситуацию с взаимодействием в системе «введенный объект – организм» понятие «биосовместимость». Под биологической совместимостью понимают свойства материала выполнять определенную функцию в организме в течение требуемого времени без вреда для него.

Наконец, обсуждая поведение полимера и изготовленного из него изделия в организме, следует отметить, что образующиеся при распаде материала продукты в той или иной степени могут включаться в процессы метаболизма (обмена веществ), лежащего в основе жизнедеятельности организма, аккумулироваться в тканях организма или могут быть выведены из него без или после дополнительных химических превращений.

Разработка хемосенсорных материалов (ХМ), состоящих из полимерных матриц, содержащих краситель или люминофор, фрагменты краун-эфиров, которые впоследствии должны использоваться в составе хемосенсора, находящегося во внутрисосудистом биороботе, является актуальной проблемой, требующей понимания выше названных проблем.

Проблема создания хемосенсоров как на различные биологически важные катионы, так и на биоорганические соединения в настоящее время также является весьма актуальной в связи с задачами медицинской диагностики, мониторинга окружающей воздушной и водной среды, развития наукоемких высокотехнологичных отраслей промышленного производства, поэтому исследования и коммерческие разработки в этой области ведутся широким фронтом во всех индустриально развитых странах. В практику экологического мониторинга внедряются новые сенсорные технологи на основе ферментных биосенсоров, молекулярных маркеров, сенсоры на основе ДНК и РНК. Известны способы экологического мониторинга путем создания системы слежения за экологическим состоянием населенных пунктов и промышленных предприятий. Для этого применяются различные технические системы сбора информации: группы датчиков экологического контроля состояния среды, контрольные и диспетчерские пункты промышленных стоков предприятий и т. п. Такие системы позволяют оценить экологическое состояние всего региона, однако они являются сложными, многостадийными, продолжительными по времени измерения и дорогостоящими. Конечной целью разработок является производство разнообразных сравнительно дешевых индивидуальных переносных сенсорных устройств, с помощью которых контролировать состояние окружающей среды мог бы не только специально обученный персонал, но и каждый желающий охранять природу [1,7,9].

Число исследований в областях создания новых сенсоров и сенсорных методик анализа стремительно растет. Сенсоры являются мощным средством не только аналитической химии, но и диагностики в самом широком смысле этого слова: в медицине, биотехнологии, экологии, ветеринарии и зоотехнии. Однако все разработки, имеющиеся в научно-технической литературе, существуют только в лабораторном исполнении.

Наиболее перспективным направлением представляется создание хемосенсорных композитных материалов (ХМ) для оптических хемосенсоров, что предполагает получение полимерной матрицы, обладающей рядом необходимых свойств (пленкообразующей способностью, оптической прозрачностью, механической прочностью, определенным влагопоглощением), и последующая иммобилизация в нее фотохромного соединения, чувствительного к катионам металлов и биологически активным веществам.

Данная работа проводилась в рамках проекта «.» по федеральной научно-технической целевой программе ФНТЦП Минобрнауки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на годы» по теме «Создание системы очувствления внутрисосудистого микроробота для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта» на г. г. кафедры органической и биологической химии ФГОУ ВПО МГАВМиБ (совместно с МГТУ имени и ЦФ РАН).

Цель работы – разработка методики, получение и исследование хемосенсорных наноструктурированных материалов на основе фоточувствительных производных краун-эфиров для детекции аминокислот и катионов кальция.

Исходя из этой цели, были поставлены задачи:

1. Получить и исследовать хемосенсорные материалы (ХМ) на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включением биоорганических соединений типа азокраун-эфирных производных стириловых красителей (КЭ). Изучить оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах. Оптимизировать методы получения и свойства ХМ.

2. Провести спектральный анализ хемосенсорных материалов с КЭ №5 в присутствии ряда аминокислот.

3. Разработать экспериментально-расчетные подходы и методики исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция.

4. Разработать рецептуру получения хемосенсорных материалов на основе желатина и иммобилизованных в него производных краун-эфиров.

5. Оценить перспективность полученных монослоев и краун-содержащих композитных материалов с основой из биополимерной матрицы и для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля щелочноземельных металлов (на примере кальция) и малых органических молекул (на примере аминокислот).

Научная новизна работы. Разработан экспериментально-расчетный метод (ЭРМ) для математического описания процессов при исследовании и получении ХМ. Разработана новая методика исследования производных краун-эфиров, селективных к катионам кальция, названная «методом контролируемой диффузии» (МКД). Посредством данной методики были изучены особенности процесса комплексообразования некоторых производных краун-эфиров с катионами кальция. Предложена новая рецептура получения сенсорных материалов на основе двух типов краун-эфиров, иммобилизованных в пленку из желатина.

Теоретическая и практическая значимость.

Получены фундаментальные результаты по фоточувствительным свойствам краунсодержащих стириловых красителей в полимерных матрицах при взаимодействии с катионами кальция и рядом аминокислот. Получены краунсодержащие композитные материалы для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля катионов кальция и ряда аминокислот. Результаты диссертационной работы используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета и в рамках НОЦ (ГК № 02.740.11.0270 и ГК № 02.740.11.0718) ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии».

Результаты работы использованы совместно с МГТУ имени и ЦФ РАН в рамках гос. контракта №02.523.12.3009 «Создание микророботехнического комплекса на основе внутрисосудистого микроробота для осуществления диагностических, терапевтических (доставка лекарственных препаратов) и хирургических процедур при атеросклеротических заболеваниях трубчатых органов», включая совместный патент РФ № 000 (см. список работ).

Основные положения, выносимые на защиту:

1.  Методики получения оптимальных по составу и свойствам матриц из синтетических и биологических полимеров.

2.  Методики изучения поведения биоорганических молекул в растворах и матричном окружении на модели фотохромных производных краун-эфиров.

3.  Данные по спектральным характеристикам комплексов биоорганического азакраун-содержащего соединения (КЭ №5) с аминокислотами: глицином, фенилаланином, аланином, серином, аргинином, изолейцином, лизином.

4.  Спектральные характеристики комплексов биоорганических азакраун - содержащих соединений (КЭ №3, №4, №6) с катионами кальция.

5.  Хемосенсорные материалы с иммобилизированными биоорганическими соединениями как элементы сенсорных устройств оптического контроля катионов кальция и некоторых аминокислот.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на III международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (МГУ, Москва, 2008); на международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ, Москва, 2008); на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГОУ ВПО МГАВМиБ (); на V Каргинской конференции (МГУ, Москва, 2010); на V Международной научной конференции «Актуальные проблемы в животноводстве» (ГНУ ВНИИФБиП с./х. животных, Боровск, 2010);на 2-й международной молодежной школе-конференции по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов (Туапсе, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 статей (в т. ч. 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК), 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях, 1 патент РФ.

Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

На молекулярно-биологическом уровне организации живой материи биологические мембраны являются одним из главных объектов изучения настоящего и будущего времени. Биологическая мембрана – это не только клеточный инструмент компартментализации – фундаментальная значимость биомембран – морфо-функциональное сопряжение разделенных сред и их структур посредством информационно-энергетического и вещественного сообщения. Данный принцип, выявляемый на молекулярно-биологическом уровне, при его реализации в многоклеточных организмах, приводит к формированию столь сложных механизмов регуляции и управления процессами в норме и патологии. При этом понятийный аппарат, используемый при изучении данных процессов на различных иерархических уровнях организации живой материи, не может быть ограничен морфо-функциональным описанием изучаемого иерархического уровня. Требуется привлечение понятийного аппарата кибернетики и информатики для глубокого материалистического осмысления информационно-вещественного дуализма в живой природе. Поэтому разработка эффективных методов изучения мембран является важным стратегическим направлением в науке. Одним из таких подходов в изучении мембран является использование таких соединений, посредством которых изменяется определяемое мембраной вещественное сообщение между средами. Особенный акцент в этом направлении следует отнести к трансмембранным ионным обменам и транспортам. К таковым соединениям можно отнести ряд антибиотиков, избирательно увеличивающих катионную проницаемость биологических мембран [10].

В шестидесятых годах XX века было обнаружено, что различные природные и синтетические нейтральные макроциклические соединения – депсипептиды, депсиды, пептиды, полиэфиры – способны связывать в растворах катионы таким образом, что последние оказываются включенными во внутреннюю полость молекулы и удерживаются там за счет межмолекулярного взаимодействия с несколькими полярными группировками (эфирными, амидными или сложноэфирными). При этом особенно выделяют донорно-акцепторные взаимодействия при таком комплексообразовании. Кроме того, была обнаружена ионная селективность подобных соединений в процессе комплексообразования, которая зависит не только от числа и природы лигандных групп, но в значительной мере определяется молекулярной конформацией. Благодаря этой специфической особенности макроциклических комплексонов среди них встречаются соединения, способные проявлять выраженную селективность в отношении определенных ионов. Комплексы, образуемые нейтральными макроциклическими соединениями, несут положительный заряд, причем стехиометрия комплексобразования, как правило, не зависит от природы связываемого катиона [10]. В таких комплексных соединениях ион металла экранирован от взаимодействия с растворителем и противоионами, что позволяет этому иону в соответствии с природой макроциклического соединения реализовывать фазовые переходы, например из раствора воды (в качестве примера полярных растворителей) «растворяться» в растворе данного макроциклического соединения, растворителем которого является хлороформ (в качестве примера неполярных растворителей).

Повышенный интерес к подобным соединениям продиктован не только их комплексообразовательной способностью, но, что важно, их селективностью в отношении определенных катионов металлов, и обеспечивании, тем самым, избирательной проницаемости для данных катионов в естественных или искусственных мембранах. С этим связана антибиотическая активность ряда соединений, продуцируемых микроорганизмами, которые являются частным примером общей группы соединений, называемых ионофорами.

Ионофоры - это довольно разнородная группа соединений, увеличивающая проницаемость мембран для ионов. Одни ионофоры, например грамицидин А и аламецитин, формируют в бислое каналы, другие образуют стехиометрические комплексы с катионами и тем самым облегчают транспорт этих ионов через липидный бислой. Ионофоры являются весьма полезными инструментами в мембранных исследованиях, особенно при изучении биоэнергетических или иных зависимых от ионного градиента систем. Поскольку такие ионофорно-катионные комплексы могут проявлять довольно высокую специфичность к определенным ионам, с их помощью можно избирательно манипулировать ионными градиентами и электрическим потенциалом на мембране. Некоторые комплексы и катиона не заряжены, и катион переносится в нейтрализованной форме. Другие комплексы заряжены и диффундируют через бислой подобно уже образовавшимся гидрофобным ионам. Рассмотрим наиболее часто используемые ионофоры.

СССР (карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон). СССР и близкий к нему FССР (карбонилцианид-n-трифторметоксифенилгидразон) представляют собой слабые кислоты. Протонированная форма электронейтральна и, как показано, легко проникают через мембрану (Р=17см/с), в то время как проницаемость депротонированной (анионной) формы составляет ≈1% от проницаемости формы нейтральной. Растворимость анионных форм этих и других протонфоров в гидрофобной области бислоя обуславливается несколькими причинами. Отрицательный заряд этих молекул делокализован, а благодаря большому ионному радиусу уменьшается энергия Борна. Кроме того, потенциал диполей, ориентированных положительным зарядом внутрь бислоя, стабилизирует анионы в мембране. И наконец, ионофор в мембране стабилизируют гидрофобные группы молекул. СССР, FССР и другие слабые кислоты эффективно увеличивают проницаемость мембраны для протонов, что позволяет достичь электрохимически равновесного распределения протонов по обе стороны бислоя.