Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 4 )

Для определения содержания ионов кальция используется очень большое количество методов: гравиметрия, титриметрические методы (комплексиметрия, окислительно-восстановительное и осадительное титрование), электрохимические методы (амперометрическое и высокочастотное титрование, определение с помощью ионселективных электродов), оптические методы (метод пламенной эмиссионной спектроскопии, метод атомно-абсорбционной спектроскопии, люминесцентный или флуоресцентный метод). Но только некоторые из них могут быть использованы для определения кальция в крови. Кальций в крови находится в нескольких формах: связанный (или в комплексе) и свободный (или ионизированный). Измерение концентрации ионизированного кальция необходимо, поскольку только ионизированная форма физиологически активна.

В последнее время для определения катионов кальция в биологических жидкостях используются следующие методики:

-  титрометрическое определение (амперометрическое, Ваарда и др.);

-  флуориметрические методы;

-  ферментативные методы (с использованием ферментов: панкреатической α-амилазы (КФ 3.2.11.1), фосфолипазы D (КФ 3.1.4), амидогидролазы мочевины (КФ 3.5.1.45);

-  фотометрические методы (пламенная фотометрия, атомно-адсорбционная и атомно-эмиссионная спектрометрия, масс – спектрометрия с изотопным разведением и др.) [15-19].

Фотометрические методы основаны на способности ионов кальция селективно связываться различными металлохромными индикаторами или красителями. Содержание кальция в исследуемом материале определяют по величине поглощения комплекса Ca2+индикатор:

Ca2+ + индикатор → окрашенный комплекс

Различают «прямые» и «непрямые» методы. В «прямых» методах реакция между ионами кальция и индикатором протекает в инкубационной среде. В «непрямых» методах образец предварительно разводят в большом объеме жидкости, чтобы высвободить кальций из комплекса с белками и другими соединениями и устранить вмешательство белков в реакцию. В настоящее время отдают предпочтение «прямым» методам. Из апробированных кальцийсвязывающих красителей, включая метилтимоловый синий, ализарин, кальцеин, хлорфосфоазо III и другие, наибольшее распространение получили о-крезолфталеин (ОКФ) и арсеназо III.

O-крезолфталеин — металлосвязывающий краситель, образует с кальцием в щелочной среде окрашенный комплекс. О содержании кальция в исследуемом материале судят по величине поглощения при длине волны 570–575 нм при pH 10–12.

Для повышения чувствительности метода и поддержания постоянного щелочного значения рН (около 12) во многих тест-системах используют диэтиламин, несмотря на то, что он обладает раздражающим действием. В ряде модификаций метода используют менее капризный 2-амино-2-метил-1-пропанол (AMP) или 2-этиламиноэтанол в качестве буферного раствора. В настоящее время полностью отказались от опасных цианидов.

Рисунок 1.7.1 Структурная формула красителя ОКФ

Для уменьшения интенсивности окраски контроля рекомендуют добавление этанола или других органических растворителей.

Методы определения кальция с ОКФ адаптированы ко многим автоанализаторам, при этом была решена существенная проблема данного метода — обеспечение температурного оптимума реакции. Результаты, полученные при определении кальция с ОКФ, завышают результаты по сравнению с методом атомно-абсорбционной фотометрии на 10–15 мг/л.

Арсеназо III стали шире использовать в последние несколько лет в качестве кальцийсвязывающего реактива.

Рисунок 1.7.2 Структурная формула арсеназо III

Он обладает высоким сродством к кальцию, при слабо кислых значениях pH=6 — большим, чем к магнию. В качестве буферного раствора используют растворы имидазола с достаточной буферной емкостью. Величину поглощения определяют при 650 нм.

Арсеназо III устойчив в виде отдельного реактива. И ОКФ, и арсеназо III широко используют для анализа кальция. По данным КАП, в США в 2001 г. около 45% лабораторий для определения кальция использовали ОКФ, 39% — арсеназо III, остальные — ионоселективный электрод. На основе арсеназо III был разработан наиболее совершенный метод определения кальция в сыворотке крови.

1.8 Создание системы очувствления ВМР для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта

Рисунок 1.8.1 Фотография модели микроробота внутри «сосуда»

Хирургический микроробот, разработанный специалистами нескольких российских институтов и предприятий, позволит диагностировать и лечить сосуды и другие трубчатые органы (кишки, желудок, мочеточники и др.) без проведения полостных операций, что существенно сократит операционное и послеоперационное время. Клинические испытания прибора должны начаться через два года.

В проекте по созданию маленького механического устройства, способного изменить привычную медицинскую практику, участвуют более сотни специалистов из МГТУ им. , РНЦ, «Курчатовского института», Института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства, , пролетарий» и Центра фотохимии РАН. Работы ведутся в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы». Проект рассчитан на пять лет и имеет бюджет в 210 миллионов рублей.

Подробнее о разработке: Микроробот представляет собой устройство диаметром 8 мм и длиной 20 мм, изготовленное из материала, чувствительного к компонентам крови, и оснащённое миниатюрной видеокамерой, ультразвуковыми приборами, электроникой для химического анализа крови и системой для удаления операционных отходов. Вводить его в организм будут через небольшой надрез в артерии или любом другом крупном или среднем сосуде, управлять извне с помощью специальной труКЭ №1и. “Микрохирург”, подобно гусенице, начнёт перемещаться по сосудам, оценивать их состояние, а также делать химический анализ крови в зоне операции, доставлять лекарства в поражённое место, вырезать бляшки и удалять отходы. Процесс операции будет транслироваться на мониторе компьютера лечащего врача. Выполнив все задачи, устройство выйдет из организма пациента, не травмируя его.

Данная работа является частью исследований, связанных с разработкой элементов для микробота.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Перечень используемых реактивов

В работе были использованы следующие реактивы:

Полимеры

1. Целлюлозы ацетатгидрофталат (ЦАГФ). Общая формула ЦАГФ [(C6H8O3)(CH3COO)(COOC6H4COOH)]n.

2. Целлюлозы ацетатбутират (ЦАБ). Общая формула ЦАБ [(C6H8O3)(CH3COO)(C3H7COO)]n.

3. Целлюлозы ацетатфталат (ЦАФ). Общая формула ЦАФ [(C6H8O3)(CH3COO)(C6H5COO)]n.

4. Поливинилбутираль (ПВБ). Общая формула ПВБ (C4H6O2C4H8)n..

5. Полистирол (ПС). Общая формула ПС (C2H3C6H5)n.

6. Поливинилхлорид (ПВХ). Общая формула (C2H3Cl)n.

(все полимеры фирмы Aldrich).

В работе использовались, помимо полимерных, гелевые матрицы. Основным гелем при получении матричного окружения являлся желатин.

Растворители

Ацетон (чда); хлороформ (чда); ацетонитрил (чда); дихлорэтан (чда); метанол (чда).

Вода бидистиллированная.

Соли

Для исследования использовались перхлораты кальция и натрия и бария Сa(ClO4)2, NaClO4, Ba(ClO4)2; хлориды кальция и натрия NaCl, CaCl2 (реактивы фирмы Aldrich).

Аминокислоты

В работе использовались следующие аминокислоты: глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин, изолейцин, лизин (реактивы фирмы Aldrich).

Краун-эфиры (оптические молекулярные сенсоры)

Исследования проводились на биоорганических соединениях на основе краун-эфиров (КЭ), в особенности – фоточувствительных КЭ, синтезированных в ЦФ РAH (КЭ № 3,4,5,6), представленных в таблице 2.1.

Таблица 2.1 Биоорганические производные КЭ

Название	Структура	Молекулярная масса
КЭ №1		312
КЭ №2		360
КЭ №3		570
КЭ №4		607
КЭ №5		1113
КЭ №6		613

2.2. Перечень используемой посуды и вспомогательных устройств

Колбы конические на 25 мл, 10 мл

Пробирки с притертыми пробками

Пипетки на слив на 10 мл, 2 мл, 1 мл, 0,1 мл

Микрошприцы емкостью 50 мкм

Стекла предметные 2,5см´7,5см

Стекла кварцевые 2,5 см´1,2 см

Колбы мерные на 100 мл

Чашки Петри

Эппендорфы

Столик для изготовления пленок горизонтальный с регулируемым уровнем

2.3. Методики, применявшиеся в работе

2.3.1. Приготовление растворов полимеров

Приготовление растворов поливинилбутираля в дихлорэтане

Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ПВБ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавляли 6,4 мл (9,6 г) дихлорэтана. Перемешивание полимера проводили в течение 60 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера.

Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ПВБ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавляли 6,4 мл (9,6 г) дихлорэтана. Перемешивание полимера проводили в течение 60 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера.

Приготовление растворов целлюлозы ацетатгидрофталата в ацетонитриле

Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетонитрила. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм.

Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетонитрила. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм.

Приготовление растворов целлюлозы ацетатгидрофталата в ацетоне

Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм.

Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАГФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм.

Приготовление растворов целлюлозы ацетатфталата

Подбор растворителя для полимера осуществлялся экспериментально. Хлороформ непригоден в качестве растворителя для ЦАФ в связи с плохой растворимость в нем полимера (не удавалось улучшить растворимость даже путем добавления этилового спирта по каплям) и большой летучести (невозможно отлить ровные тонкие пленки). В связи с этим было принято решение использовать в качестве растворителя ацетон, оказавшийся оптимальным по вышеперечисленным показателям.

Для приготовления 4% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,40 г ЦАФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки добавляли 12,3 мл (9,6 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 10 и 20 мкм.

Для приготовления 8% раствора полимера в коническую колбу емкостью 25 мл помещали 0,80 г ЦАФ. При непрерывном перемешивании с помощью пипетки на 10 мл добавили 11,6 мл (9,2 г) ацетона. Перемешивание полимера проводили в течение 15 минут при комнатной температуре до полного растворения полимера. Сразу же после растворения полимера отливали пленки толщиной 40 мкм.

Приготовление растворов желатина в воде

Для приготовления раствора желатина брали 10 г желатина, растворяли в 10 мл кипящей дистиллированной воды. Далее полученный раствор желатина объемом 3 мл добавляли в пробирку площадью 1 см2 для отлива пленки толщиной 40 мкм по стандартной методике полива пленок.

Приготовление растворов желатина с бензо-18-краун-6 (КЭ №1) в воде

Для приготовления раствора желатина брали 10 г желатина, растворяли в 10 мл кипящей дистиллированной воды. К 3 мл полученного раствора желатина для отлива пленки толщиной 40 мкм по стандартной методике добавляли 500 мг КЭ №1, и получали желатиновую систему, содержащую сенсор и КЭ №1 в расчетном соотношении.

2.3.2. Приготовление растворов краун-эфиров

Приготовление раствора краун-эфира № 3 в ацетонитриле

Навеску 0,00057 г КЭ №3 растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и получали раствор КЭ №3 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в ацетонитриле получался прозрачный раствор вишневого цвета.

Приготовление раствора краун-эфира № 3 в хлороформе

Навеску 0,00057 г КЭ №3 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №3 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор вишневого цвета.

Приготовление раствора краун-эфира №6 в хлороформе

Навеску 0,00061 г КЭ №6 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №6 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор темно-вишневого цвета.

Приготовление раствора краун-эфира № 4 в хлороформе

Навеску 0,0006 г КЭ №4 растворяли в 1,0 мл хлороформа и получали раствор КЭ №4 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в хлороформе получается прозрачный раствор синего цвета.

Приготовление раствора краун-эфира № 5 в ацетонитриле

Навеску 0,0011 г КЭ №5 растворяли в 1,0 мл ацетонитрила и получали раствор КЭ №5 с концентрацией 1 ммоль/л (мМ). В процессе растворения КЭ в ацетонитриле получается прозрачный раствор желто-зеленого цвета.

2.3.3. Проверка совместимости растворов полимера и краун-эфира

Перед получением пленок проверялась совместимость раствора полимера с растворами КЭ. Для этого в пробирку помещали небольшое количество смеси исследуемых растворов и наблюдали за возможным помутнением. Если не наблюдалось ни выпадения осадка, ни помутнения растворов, считали, что растворы полимера и красителя совмещаются хорошо.

2.3.4. Приготовление растворов солей

Для приготовления растворов перхлората кальция Са(ClO4)2, хлорида кальция СаCl2 использовалась бидистиллированная вода. Готовились растворы с концентрацией 1, 2, 5, 50, 60 ммоль/л. В работе также использовались смеси хлоридов кальция и натрия с концентрациями, равными 5:150 и 5:50 ммоль/л, соответственно (растворитель - бидистиллированная вода).

2.3.5. Приготовление совместных растворов полимеров и краун-эфиров для полива пленок

Совместные растворы получали введением по каплям раствора краун-эфира в раствор полимера. В полученном растворе масса краун-эфира всегда составляла 1% от массы полимера.

Приготовление раствора краун-эфира № 3 и ПВБ для полива пленки

Для полива одной пленки в 0,18 мл 4% раствора ПВБ в дихлорэтане по каплям добавляли 0,068 мл раствора КЭ №3 в хлороформе. После перемешивания растворов проводили полив пленок.

Приготовление раствора краун-эфира № 3 в ЦАГФ для полива пленки

Для полива одной пленки в 0,26 мл 4% раствора ЦАГФ в ацетонитриле и 0,074 мл раствора КЭ №3 в ацетоне. После перемешивания растворов проводили полив пленок.

2.3.6. Получение полимерных пленок

Из приготовленных растворов отливали тонкие пленок на стеклянных подложках (для исследования влагопоглощения) и кварцевых подложках (для получения спектров поглощения и флуоресценции). Стекла готовили к поливу пленок путем обезжиривания с помощью погружения на 15 мин в хромовую смесь. После тщательного промывания в дистиллированной воде стекла просушивали на воздухе до полного высыхания. После этого стекла располагали на специальном горизонтальном столике с регулируемым уровнем. На стекла с помощью пипетки наносили раствор полимера по каплям по всей площади стекла. Пленки отливали под вытяжкой при комнатной температуре и накрывали чашкой Петри, чтобы создать внутри насыщенную атмосферу паров растворителя, необходимую для равномерного высыхания пленки (во избежание волнистости пленки, приводящей к неравномерной ее толщине на разных участках).

Рисунок 2.1.1 Столик с кварцевыми подложками для полива полимерных пленок.

Расчет количества полимера, необходимого для нанесения на подложку

Масса полимера на одну пленку вычисляется по формуле:

M=ρ∙S∙h∙10-4

где ρ - плотность раствора полимера (г/см3);

S - площадь подложки (см2);

h - толщина слоя полимера для полива на подложку.

Объем раствора полимера вычисляли, исходя из процентной концентрации и плотности раствора.

Получение полимерных пленок с краун-эфирами

Для полива пленок использовали стандартные кварцевые стекла размером 37´12 мм. Предварительно стекла обезжиривали, погружая на 15 мин. в хромовую смесь. После тщательного промывания в дистиллированной воде стекла просушивали на воздухе до полного высыхания. После этого стекла располагали на специальном горизонтальном столике с регулируемым уровнем. На стекла с помощью пипетки на 1 мл наносили раствор полимера и КЭ по каплям по всей площади стекла. Пленки отливали под вытяжкой при обычных условиях. После полива пленки накрывали чашкой Петри, покрытой сверху фольгой. Высушивали пленки в парах растворителя в течение суток. Полученные пленки хранили в холодильнике в контейнерах, защищенных от света. Толщина краунсодержащих пленок составляла 10 – 40 мкм.

Достоинством метода является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и краунсодержащего соединения (КЭ) в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо.

2.3.7. Определение концентрации катионов кальция в водном растворе посредством хелатометрического титрования

Для титрования катионов кальция использовали стандартный раствор ЭДТА. Индикатором являлся мурексид. Ход определения: 50 мл исходного водного раствора переносится в колбу для титрования, переливается 2,5 мл 2 н. раствора NaOH. Далее вносится на конце шпамг смеси индикатора мурексида с хлоридом натрия. Затем медленно титруется полученная жидкость 0,05 н. раствором ЭДТА до перехода розовой окраски в сине-фиолетовую, не исчезающую в течение 3 мин. Далее проводится 3-4 разовое повторение опыта и из исходящего отчета выбирается среднее значение. Концентрация кальция вычисляется по следующей формуле:

С(Са)=С(ЭДТА)∙V(ЭДТА)/V(Са),

где: С(Са) – концентрация Са2+( моль/л)

С(ЭДТА) – концентрация ЭДТА (моль/л)

V(ЭДТА) – объем водного раствора ЭДТА (л)

V(Са) – объем водного раствора Са2+(л).