Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 5 )

В ходе проведения экспериментов выбранные оптимальные значение объемов и концентраций компонентов опыта не всегда совпадали, однако соотношения этих компонентов сохранялись.

2.3.8. Получение монослоев смеси КЭ №5 и стеариновой кислоты

Получение монослоев КЭ №5 осуществлялось посредством метода Лэнгмюра-Блоджет. Для КЭ №5 растворяли в ацетоне в концентрации 1 мМ и на водную поверхность в ванне Лэнгмюра распределяли полученный раствор КЭ №5 в объеме 2 мл. Далее готовили раствор стеариновой кислоты (С18) в хлороформе с концентрацией 1 мМ. Полученный раствор, объемом 4 мл, также распределяли на водную поверхность ванны Лэнгмюра с уже внесенным раствором КЭ №5. В результате получали монослой смеси КЭ №5:С18 в отношении 1:2. Этот монослой также получали не на водной поверхности, а на поверхности водного раствора лизина, с концентрацией 1 мМ. Далее снимали изотермы поверхностного давления и поверхностного потенциала полученного монослоя. После перенесения монослоя на твердый носитель снимали спектры поглощения и флуоресценции.

2.3.9. Методика измерения спектров поглощения

Для снятия спектров поглощения использовали полимерные пленки, отлитые на кварцевых подложках, а также растворы краун-эфиров. Исследования проводили на спектрофотометре Hitachi 330 (Япония) и «Helios β», (Германия) с использованием кварцевых кювет и носителей. Сравнивали спектры поглощения чистого полимера и полимера с добавлением КЭ в области 300-700 нм. В пленке, где присутствует КЭ, наблюдалось появление характерного выраженного пика, максимум которого наблюдался при соответствующей длине волны.

Затем пленки, содержащие КЭ, подвергали воздействию водных растворов солей с концентрацией 1 М в течениемин. Снова снимали спектры поглощения и наблюдали изменения интенсивности и длины волны максимума поглощения.

Для измерения использовали сухие пленки или растворы, помещенные в кювету для спектрометрии с длиной оптического пути 10 мм и высотой 45 мм, заполненную раствором «аналита» и закрытую фторопластовой прокладкой.

1)  Образец помещается в кюветное отделение спектрофотометра.

2)  В кювету сравнения помещается образец без сенсорного материала (раствор «аналита»).

3)  Кювета с образцом и кювета сравнения помещается в соответствующие кюветные отделения спектрофотометра.

4)  Измерение спектра производится в спектральном диапазоне 300-700 нм с шагом 1 нм в соответствии с техническим описанием спектрофотометра.

5)  Спектр записывается на электронном носителе в текстовом формате и в виде графического файла в формате Origin, также предоставляются параметры записи спектров.

6)  Пункты 2 - 5 выполняются дважды: один раз - без «аналита», а второй раз в присутствии «аналита».

Статистическая обработка результатов

Приборная ошибка при снятии спектров поглощения составляет 1%.

Ошибка измерения длины волны максимума поглощения, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 2 нм (0,7%).

Ошибка измерения интенсивности поглощения, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,043 (0,7%). Пример расчета ошибки приведен ниже.

Таблица 2.2 Расчет ошибки измерения длины волны поглощения

№	Xi, нм						Результат, нм n=5 α=0,95 tα=2,78
1	446	447,2	1	1	1,25	1,5	447±2
2	447	0	1
3	448	1	1
4	447	0	1
5	448	1	1
∑ Xi=2200		∑ (Xi-X)=20

Таблица 2.3. Расчет ошибки измерений интенсивности поглощения

№	Xi, ед.						Результат, ед. n=5 α=0,95 tα=2,78
1	0,158	0,153	0,004	0,000016	0,0001	0,012	0,153±0,012
2	0,161	0,007	0,000049
3	0,141	0,013	0,000169
4	0,162	0,008	0,000064
5	0,146	0,008	0,000064
∑ Xi=0,768		∑ (Xi-X)= 0,000262

Рисунок 2.2.1 Спектрофотометр HITACHI 330.

Рисунок 2.3.1 Кюветное отделение спектрофотометра HITACHI 330.

2.3.10. Методика измерения спектров флуоресценции

Для снятия спектров флуоресценции использовали тонкие пленки, отлитые на кварцевых подложках, а также растворы краун-эфиров. Исследования проводили на спектрофотометрах «Hitachi 550» и SHIMADZU RF 5001 (Япония) с использованием кварцевых кювет и носителей. Сравнивали спектры флуоресценции чистого полимера и полимера с добавлением КЭ в области 300-700 нм. В пленке, где присутствует КЭ, наблюдалось появление характерного выраженного пика, максимум которого наблюдался при соответствующей длине волны.

Затем пленки, содержащие КЭ, подвергали воздействию водных растворов солей с концентрацией 1 М в течениемин. Снова снимали спектры флуоресценции и наблюдали изменения интенсивности и длины волны максимума флуоресценции.

Для измерения использовали сухие пленки или растворы, помещенные в кювету для флуориметрии с длиной оптического пути 10 мм и высотой 45 мм, заполненную раствором «аналита» и закрытую фторопластовой прокладкой.

1)  Образец помещается в кюветное отделение спектрофлуориметра.

2)  В кювету сравнения помещается образец без сенсорного материала (раствор «аналита»).

3)  Кювета с образцом и кювета сравнения помещается в соответствующие кюветные отделения спектрофлуориметра.

4)  Измерение спектра производится в спектральном диапазоне 300-700 нм с шагом 1 нм в соответствии с техническим описанием спектрофлуориметра.

5)  Спектр записывается на электронном носителе в формате данных и в виде графического файла в формате Origin, также предоставляются параметры записи спектров.

6)  Пункты 2 - 5 выполняются дважды: один раз - без «аналита», а второй раз в присутствии «аналита» (время воздействия «аналита»мин).

Статистическая обработка результатов измерения спектров флуоресценции

Приборная ошибка при снятии спектров флуоресценции составляет 0,1%.

Ошибка измерения длины волны максимума флуоресценции, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,6 нм (0,1%). Ошибка измерения интенсивности флуоресценции, вычисленная по результатам экспериментов, составляет 0,6 (0,1%). Пример расчета процента ошибки приведен ниже.

Таблица 2.4 Расчет ошибки измерений длины волны флуоресценции.

№	Xi, нм	Xср.	d	d2	S	εα	Результат, нм
1	592	591	1	1	1,5	0,6	542±1
2	591	0	0
3	591	0	0
4	592	1	1
5	592	1	1
∑ Xi=2951		∑ (Xi-X)=3

Таблица 2.5 Расчет ошибки измерений интенсивности флуоресценции.

№	Xi, ед.	Xср.	d	d2	S	εα	Результат, ед.
1	801	801	0	1	2,5	0,6	409±1
2	802	1	1
3	801	0	1
4	802	1	1
5	800	1	1
∑ Xi=4006		∑ (Xi-X)=5

Рисунок 2.4.1 Спектрофлуориметр SHIMADZU RF 5001

Рисунок 2.5.1 Кюветное отделение спектрофлуориметра SHIMADZU RF 5001

Рисунок 2.6.1 Держатель для пленок на кварцевых или стеклянных подложках

Рисунок 2.7.1 Держатель для кювет

2.3.11. Методика построения графиков в "OriginPro70"

1. Запускается программа "OriginPro70".

2. С помощью функции "Import ACSII" открывается файл данных полученный со спектрофотометра или спектрофлуориметра.

3. Обозначаются колонки значений как Х и Y.

4. Выделяется колонки правой клавишей мыши.

5. Используя функцию "Line" в подменю "Plot" на панели инструментов, строится график.

6. Проводится корректировка графика, для этого его нужно выделить, нажать правую кнопку мыши и, используя функцию "Axis", задать необходимые параметры.

7. Для определения пика используется функция "Pick Peaks" в подменю Tools.

8. Для апроксимации графика Гауссовской кривой используется функция "Fit Gaussian" в подменю "Analysis".

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использовали полимерные матрицы с иммобилизованными КЭ, которые, при контакте с биогенными «аналитами», дают молекулярные комплексы. Такую систему можно рассматривать как продукт бионанотехнологий, поскольку все реагенты образуют наноразмерные комплексы, а процесс получения хемосенсорного материала проводится по оригинальной технологии.

КЭ являются соединениями, моделирующими ряд биохимических функций биологически активных соединений (БАС) и позволяющими создавать супрамолекулярные системы, имеющие как фундаментальное, так и практическое значение. Одной из таких важнейших функций является образование комплексов БАС с катионами металлов и малыми органическими молекулами. Достоинством производных КЭ, используемых в данной работе, являются их способность к изменению оптических характеристик (спектров абсорбции и флуоресценции) при их комплексообразовании.

Для возможности оценки комплексообразования КЭ с катионами металлов, находящихся в водном растворе, в качестве модели было проведено исследование процесса взаимодействия КЭ №3 с катионами бария в растворе ацетонитрила. Как уже упоминалось в литературном обзоре, такое взаимодействие, приводящее к комплексообразованию, хорошо выявляется изменением таких спектральных характеристик системы, как сдвиг максимума длины волны в спектрах поглощения и/или флуоресценции.

Для снятия спектров флуоресценции использовали раствор КЭ №3 в ацетонитриле с концентрацией 10-3 М в отсутствие и в присутствии катионов бария, концентрация которого также составляла 10-3 М. Данные приведены на рис. 3.1. Видно, что в спектре КЭ №3, растворенного в ацетонитриле, наблюдается максимум при длине волны λ=660 нм (кривая 1). При добавлении перхлората бария, растворенного в ацетонитриле, к раствору КЭ №3 в ацетонитриле, в объемном соотношении 1:1, наблюдается сдвиг максимума длины волны флуоресценции с 660 нм до 596 нм (кривая 2). При использовании объемного соотношения КЭ №3 : Ba(ClO4)2 = 1:10 наблюдается сдвиг максимума длины волны флуоресценции с 660 нм до 555 нм (кривая 3).

Рисунок 3.1.1 Спектры флуоресценции КЭ №3, растворенного в ацетонитриле: до взаимодействия с Ba(ClO4)2 (кривая 1); после взаимодействия с Ba(ClO4)2 в объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:1 (кривая 2); после взаимодействия с Ba(ClO4)2 в объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:10 (кривая 3). [КЭ №3] = 10-3 M, [Ba(ClO4)2]= 10-3 M.

Приведенные данные показали, что при взаимодействии катиона Ba2+ c КЭ №3 наблюдается явно выраженный сдвиг максимума длины волны флуоресценции в коротковолновую область (гипсохромный сдвиг), который зависит от количества указанного катиона. Так, этот сдвиг Δλ=λ – λ0 (где λ0 – максимум длины волны КЭ №3 в ацетонитриле, λ – то же, но после взаимодействия с катионом) при объемном соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2=1:1 составил -64 нм (в коротковолновую область), а при соотношении КЭ №3:Ba(ClO4)2 = 1:10 составил -105 нм (в коротковолновую область). Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными и свидетельствуют о наличии комплексообразования между КЭ №3 и катионом бария в растворе ацетонитрила. Это позволяет предположить, что КЭ №3 можно использовать для детекции и других катионов металлов, например, катионов кальция.

3.1 Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода

Достоинством получения пленок методом полива является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и КЭ в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо. С целью повышения чувствительности ХМ и экономии КЭ была разработана модифицированная методика, суть которой состоит в следующем. При стандартном методе получения пленок из раствора (содержащего одновременно и полимер, и КЭ) КЭ распределяется в полимерной матрице равномерно по всей толщине. Поскольку среда пленки гидрофобна, то это создает препятствия для проникновения катиона растворенного в воде «аналита» вглубь пленки. В модифицированном методе изготавливают двухслойную пленку, первый слой которой получен из раствора полимера, а второй — из раствора КЭ, причем могут быть использованы разные растворители. В такой пленке концентрация КЭ в поверхностном слое возрастает, что должно приводить к повышению чувствительности ХМ и, соответственно, выражаться в спектральных данных.

3.1.1 Сущность модифицированной методики

Сущность модифицированного метода состоит в следующем. На стекло наносят раствор полимера с концентрацией 4%, смешанный с чистым растворителем, объем которого равен или превышает объем предполагаемого раствора КЭ. При этом важно отметить, что растворитель может быть идентичным растворителю раствора полимера, может быть близок ему по свойствам и растворению определенной группы полимеров (например, хлороформ и ДХЭ), а может быть представлен смесью растворителей, из которых один растворитель растворяет полимер, а другой - нет. Такой раствор наносят на стекло и накрывают чашкой Петри. В микропробирку вносят раствор КЭ, в который добавляют растворитель, объем которого может соответствовать предполагаемому раствору полимера (как в случае стандартной методики), и эту смесь наносят на уже распределенный на стекле раствор полимера. Отмечено, что внесение избыточного объема растворителя для создания насыщенного пара положительно влияет на характер формирования пленки. При этом растворитель в жидкой фазе можно нанести непосредственно на общее стекло, где пленка формируется, а можно внести в единый замкнутый объем (под чашку Петри), а нанесение КЭ осуществлять, как описано в модифицированной методике.

Экспериментально установлено, что, варьируя концентрации растворенных веществ (полимера и КЭ), можно добиться более эффективной регуляции кинетики удаления растворителя, особенно в сочетании с дополнительным внесением в объем избыточного пара растворителя, удобства распределения материала на подложке и получение качественной пленки.

Было предположено, что от метода изготовления пленки зависит и ее молекулярная структура. Это основано на том, что в одних случаях удается встроить КЭ на поверхность, а в других нет, при этом от метода получения зависит оптическая плотность пленок. Например, при слишком быстром испарении растворителя из формирующейся пленки, она мутнеет. Было выяснено, что чем меньше концентрация полимера в растворе, из которого формируется пленка, тем лучше качество пленки (нет помутнения, возможна иммобилизация КЭ без смешивания с дополнительным раствором полимера и т. д.).

Спектры поглощения ХМ, состоящего из КЭ №5, иммобилизованного в пленку ЦАГФ, полученного по стандартной и модифицированной методике, изображены на рис. 3.1.1. Хемосенсорный материал подвергался воздействию «аналита» в виде гептаметиленаммоний бромида, растворенного в воде.

а

 

б

Рисунок 3.1.1 Спектры поглощения КЭ №5 в пленках ЦАГФ до (кривая 1) и после (кривая 2) контакта с раствором «аналита», полученные по стандартной (а) и модифицированной (б) методике

Результаты эксперимента показывают, что материал, полученный по модифицированной методике, обладает большей чувствительностью. В этом случае (рис. б) на спектрах виден значительно больший сдвиг максимума длины волны поглощения, чем на спектре, полученном стандартным методом полива (рис. а).

Еще одно преимущество модифицированной методики перед стандартной состоит в получении более гладких и однородных пленок. Важно также, что появляется возможность встраивания любого КЭ в любую полимерную матрицу за счет варьирования растворителями на базе двух самостоятельных растворов при их нанесении на стекло, что снимает необходимость в проведении исследований на совместимость раствора полимера и раствора КЭ и является технологическим преимуществом.

На базе вышеописанной методики было предложена оптимальная схема, используемая в приготовлении сенсорных материалов на основе КЭ №3 и желатина. На распределенный по поверхности кварцевой подложки раствор полимера (например, желатина) наносится по каплям строго рассчитанный объем раствора сенсора в определенном окружении (системе растворителей) для вещественной иммобилизации данного сенсора в предлагаемую матрицу. Результаты этих экспериментов будут описаны ниже.