Спектральные методы в химико-токсикологическом анализе (стр. 5 )

Основатель хроматографического метода - русский учёный Михаил Семенович Цвет, который впервые в 1903 г использовал для разделения растительных пигментов.

Классификация хроматографических методов анализа. Методы хроматографии классифицируют по: агрегатному состоянию фаз, механизму разделения, аппаратурному оформлению процесса и по способу перемещения подвижной фазы и хроматографируемой смеси.

По агрегатному состоянию фаз различают жидкостную и газовую хроматографию.

По механизму разделения различают сорбционные методы, которые основаны на законах распределения (адсорбционная, распределительная, ионообменная хроматография и др.), гельфильтрационные (проникающая хроматография), которые основаны на различии в размерах молекул разделяемых веществ. На практике часто реализуются одновременно несколько механизмов разделения.

По аппаратурному оформлению процесса хроматографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных колонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумажной - на специальной бумаге.

По способу перемещения подвижной фазы и хроматографируемой смеси различают фронтальную и элюентную хроматографию.

При непрерывном введении в хроматографическую колонку растворенной смеси в чистом виде выделяется только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Остальные вещества выходят из колонки в виде смеси. Этот метод называют фронтальной хроматографией.

В методе элюентной хроматографии через колонку пропускают подвижную фазу (элюент), вводят пробу и снова пропускают подвижную фазу. В процессе движения по колонке компоненты смеси разделяются на зоны. Эти зоны разделены зонами чистого растворителя и выходят из колонки поочередно.

Хроматография в тонком слое сорбента, или тонкослойная хроматография, Thin Layer Chromatography (ТСХ, TLC) - один из эффективных методов хроматографического анализа. Механизм разделения веществ, как правило, является адсорбционным.

Хроматографирование осуществляется на пластинке, равномерно покрытой слоем сорбента. Различают незакрепленный и закрепленный слои сорбента. Размер частиц сорбента обычно 5-40 мкм.

В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. В современной хроматографии в основном используются пластины заводского изготовления, отличающиеся размерами, носителями и подложками.

Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимерного материала (например, политерефталата). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, тяжелая, не делится на несколько частей без повреждения слоя сорбента), наибольшее распространение получили пластины на основе алюминиевой фольги или полимерных материалов.

В качестве сорбента в ТСХ применяют диоксид кремния - силикагель, оксид алюминия, целлюлозу, полиамидные смолы, активированный уголь и другие вещества с высокой адсорбционной способностью. Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль, удерживающие зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - равномерная толщина слоя по всей поверхности хроматографической пластинки.

При выборе растворителей в ТСХ учитывают их элюирующую способность – способность вытеснять соединения, сорбированные на неподвижной фазе. Элюирующая способность зависит от свойств растворителя и сорбента. Выбор растворителя для ТСХ облегчает существование элюотропного ряда для данного сорбента, в котором растворители расположены в порядке возрастания их полярности: циклогексан, четыреххлористый углерод, трихлорэтилен, толуол, бензол, дихлорэтан, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, пропанол, этанол, метанол, вода. Смешивая два растворителя из начала и конца элюотропного ряда и меняя их количества, подбирают систему растворителей в качестве подвижной фазы.

Нанесение пробы - это важный этап, обеспечивающий качество хроматограммы. Анализируемую пробу наносят с помощью капилляра на линию старта пластинки (6-8 мм от края) в виде раствора, желательно в неполярном и легкоиспаряющемся растворителе. Существенными факторами являются точность нанесения пятна и минимизация их диаметра. Обычно для анализа достаточно 0,1-20 мкг вещества, а наносимое пятно должно быть не более 2 мм в диаметре. При одновременном хроматографировании нескольких образцов расстояние между точками нанесения должно быть не менее 6-8 мм. В случае слишком большого количества образца адсорбционной емкости сорбента может оказаться недостаточно, и вещество, которое не сможет полностью адсорбироваться, будет растворяться в элюенте. В этом случае получаются слишком вытянутые пятна («хвосты») и вещества с близкой хроматографической подвижностью могут слиться в одно вытянутое пятно. Минимальное количество нанесенного образца лимитируется порогом чувствительности метода обнаружения пятна на пластинке.

Эффективность разделения веществ заметно возрастает при использовании высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). За счет создания принудительного движения подвижной фазы с регулируемой скоростью, уменьшения размера частиц сорбента (до 5-7 мкм) и насыщения пространства над пластиной парами растворителя удается существенно ускорить процесс хроматографирования и повысить четкость разделения.

Разделение веществ осуществляют в хроматографических камерах, куда помещают пластинку с нанесенными образцами. Элюент, продвигаясь за счет капиллярных сил по пластинке, увлекает за собой разделяемые вещества. По окончании хроматографирования отмечают положение фронта растворителя.

Если анализу подвергаются два вещества, А и Б и их смесь В, то каждое из веществ проходит определенное расстояние, замеряемое от линии нанесения (старта) до центра пятна. Положение пятен на хроматограмме характеризуется величинами Rf (ratio of fronts – отношение фронтов), которые представляют собой отношения расстояний, пройденных веществом, к расстоянию, пройденному элюентом (рис. 14.1).

Рис. 14.1. Схема обработки тонкослойной хроматограммы после проявления пятен определяемого вещества и свидетеля (стандарта).

a – расстояние, пройденное определяемым веществом (о);

b – расстояние, пройденное подвижной фазой;

ast – расстояние, пройденное стандартным образцом (О).

= ; = ; =

Значения Rf для каждого вещества при определенных условиях является константой. Для многих веществ эти значения приводятся в справочной литературе и могут применяться для идентификации веществ. Однако значения Rf в заметной степени зависят от условий хроматографирования (природы и качества растворителя и сорбента, температуры и др.), которые в точности соблюсти практически невозможно. Поэтому более надежным доказательством идентичности исследуемого вещества его стандарту является совпадение величин Rf, полученных на одной хроматограмме, а не путем сопоставления со справочными данными. С этой целью вещество известного строения, называемое свидетелем, хроматографируют одновременно с анализируемым веществом. Несовпадение величин Rf анализируемого вещества и свидетеля полностью исключает их тождественность, вместе с тем совпадение еще не является полной гарантией идентичности двух веществ. Надежность идентификации значительно повышается, если одинаковые значения Rf анализируемого вещества и свидетеля (стандарта) получены при хроматографировании в нескольких растворителях.

Обнаружение веществ на хроматограммах осуществляют по пятнам при хроматографировании окрашенных веществ. Однако большинство органических веществ бесцветны, поэтому пятна обнаруживают химическими или оптическими методами.

Высушенную от растворителя (элюента) пластинку опрыскивают (если слой сорбента закреплен) химическим реагентом, дающим окрашенные продукты с анализируемыми веществами. Другим вариантом обнаружения пятен является проявление в парах йода, для чего пластинку помещают в закрытый сосуд, в котором находятся несколько кристалликов йода. Через 15-20 мин пластинку вынимают, избыток йода испаряется на воздухе. На месте органических веществ остаются желто-коричневые пятна.

Некоторые вещества, например углеводы, обугливаются при нагревании до 250-300оС, что может быть использовано для их обнаружения. Вещества, поглощающие УФ-излучение, возможно обнаружить при рассмотрении пластинки под УФ-лампой.

Методом ТСХ можно проводить препаративное разделение, для чего используют пластинки с большей толщиной слоя сорбента (1-2 мм). Препаративное разделение используют в случае необходимости накопления вещества. Раствор разделяемой смеси наносят полосой на линию старта по всей ширине пластинки. После обычной процедуры хроматографирования компоненты смеси располагаются горизонтальными зонами, которые удобнее всего обнаруживать в УФ-свете. При использовании химических реагентов опрыскивают узкую боковую полосу у края пластинки. Обнаруженные зоны снимают с пластинки (кроме опрысканной полосы) и вымывают из них вещества подходящим растворителем. На пластинках шириной 15-20 см этим методом можно разделить до 100 мг смеси веществ.

Роль ТСХ в аналитической токсикологии. Хроматографические методы продолжают оставаться основным инструментом аналитической токсикологии. По темпам развития среди них первые места занимают высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография и хромато-масс-спектрометрия (ГХ/МС, ЖХ/МС). Однако остается значительной и роль хроматографии в тонком слое (ТСХ), Этот метод сыграл большую роль в аналитической токсикологии, когда ВЭЖХ и ЖХ/МС еще не были доступны для широкого использования. Полуколичественный вариант ТСХ является и в настоящее время недорогим и эффективным методом разделения, идентификации и полуколичественного определения веществ, в том числе и токсикантов. В настоящее время ТСХ ипользуется как альтернативный аналитический метод для подтверждения идентификации токсичных веществ в первую очередь при скрининговых исследованиях в химико-токсикологическом анализе. Все пробы, давшие "положительную" реакцию, далее исследуют каким-то более специфическим инструментальным методом (ГХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ЖХ/МС), в то время как все отрицательные результаты скрининга принимают как окончательные без какой-либо проверки.