Спектральные методы в химико-токсикологическом анализе (стр. 1 )

1. Спектральные методы в химико-токсикологическом анализе.

Структура занятия:

I.  Входной тест.

II.  Семинар «Токсикологическая характеристика парацетамола. Спектрофотометрический анализ».

III. Лабораторная работа «Химико-токсикологический анализ таблеток, найденных на месте происшествия (на примере парацетамола)».

Целевые задачи:

-  освоить принципы, лежащие в основе спектрального анализа;

-  научиться идентифицировать токсичные вещества по УФ - и ИК- спектрам;

-  научиться проводить химико-токсикологическое определение неизвестных лекарственных средств (ЛС), найденных на месте происшествия.

Краткое теоретическое введение

Парацетамол - N-(4-гидроксифенил)- ацетамид, п-ацетаминофенол (ацетаминофен):

Применяется в медицинской практике в качестве анальгезирующего, жаропонижающего и слабого противовоспалительного средства. Механизм действия основан на ингибировании синтеза простогландинов, в результате чего уменьшается возбудимость центра теплорегуляции гипоталамуса. Частота отравления жаропонижающими и нестероидными противовоспалительными средствами составляет примерно 12%. Парацетамол в этой группе лекарственных средств является наиболее часто употребляемым, в том числе и в педиатрии. Суточная доза может достигать 4 г. Органы-мишени токсического действия парацетамола − печень и почки. Кроме того, токсические дозы парацетамола вызывают поражение кроветворной системы (развитие анемии, агранулоцитоза, тромбоцитопении) (Приложение 12.1).

Парацетамол проявляет слабые кислотные свойства (рКа = 9,38), вследствие своей липофильности быстро всасывается из ЖКТ. Время tmax достижения максимальной концентрации Cmax в крови составляет около часа. Определение парацетамола в плазме при передозировке можно проводить и через 4 ч после отравления, что связано с увеличением периода его полувыведения t1/2 при повреждении печени токсическими дозами лекарственного вещества. Токсические концентрации парацетамола в плазме выше 50 мкг/мл (>300 мкмоль/л) указывают на острое отравление и высокую вероятность гепатотоксического действия.

Токсикодинамические и токсикокинетические характеристики парацетамола

Токсическая концентрация в крови (через 4 ч после отравления), мкг/мл > 50

Биодоступность, % 100

Доля выведения с мочой, % 4-6

Степень связывания с белками, % 25-50

Период полувыведения, t1/2, ч 1-4

В лечебных дозах парацетамол биотрансформируется на 94% с образованием полярных сульфатов и глюкуронидов, которые выводятся с мочой. Около 4% парацетамола окисляются (цитохром Р-450) и связываются с глутатионом. При передозировке в печени накапливаются токсичные продукты окисления, вызывающие некроз клеток. При тяжелом отравлении у 10-40% больных наблюдается острый некроз паренхимы почек, вызываемый действием метаболита – п-аминофенола, образующегося при дезацетилировании парацетамола.

Спектральные методы анализа

Спектральные методы анализа основаны на взаимодействии вещества с электромагнитным излучением, в результате которого происходит избирательное поглощение молекулой определяемого вещества энергии света (Приложение 12.2).

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра. Поглощение света молекулами органических соединений в УФ (200 – 400 нм) и видимой (400 – 800 нм) областях обусловливает возникновение электронных спектров (перемещение электронов со связывающих σ- и π-, несвязывающих n- на разрыхляющие σ*- и π*- молекулярные орбитали). Спектр поглощения представляет собой зависимость интенсивности поглощения (А) от длины волны (λ,нм).

В основе спектрофотометрических измерений и расчетов лежит закон, характеризующий зависимость поглощения монохроматического излучения от толщины поглощающего слоя и концентрации анализируемого раствора (закон Бугера–Ламберта–Бера), который можно представить в экспоненциальной форме

I=I0 · е - kc

или в логарифмической форме

A=lg (I0/I) =εlc,

где I0 - интенсивность светового потока, проходящего через светопоглощающую среду; I - интенсивность светового потока, прошедшего через эту среду; k - коэффициент светопоглощения; с - концентрация раствора; l - толщина поглощающего слоя; A=lg (I0/I) - абсорбция (поглощение), которую также называют экстинкцией. ε=k/2,3 - молярный коэффициент экстинкции (л·моль-1·см-1). Численно молярный коэффициент экстинкции равен абсорбции при концентрации анализируемого раствора с= 1 моль/л и толщине поглощающего слоя l= 1 см.

Если концентрацию раствора выразить в граммах растворенного вещества, содержащегося в 100 мл раствора, то коэффициент пропорциональности в уравнении обозначится как Е1см1% - удельный коэффициент поглощения. Молярный и удельный коэффициенты поглощения связаны между собой соотношением:

ε=E M/10,

где М - молярная масса растворенного вещества.

При проведении фотометрических измерений в видимой области спектра предварительно, если это необходимо, проводят хромогенную химическую реакцию с образованием окрашенного продукта из исходного анализируемого вещества. Затем подбирают аналитическую длину волны (соответствующую максимуму поглощения в спектре анализируемого вещества), концентрацию анализируемого раствора, толщину поглощающего слоя и готовят раствор сравнения («нулевой» раствор). Раствор сравнения представляет собой либо чистый растворитель, либо растворитель, содержащий все те же компоненты и в тех же количествах, что и анализируемый раствор, за исключением определяемого вещества.

Фотометрические измерения целесообразно проводить в интервале изменения поглощения А от 0,2 до 0,8, в соответствии с этим подбирают концентрацию анализируемого раствора. Так как минимальная систематическая ошибка получается при А=0,434 и l=1см, то концентрация должна быть примерно равна с=0,434/ ε.

Концентрацию вещества в анализируемом растворе находят на основании результатов фотометрических измерений различными методами: градуировочного графика; добавок стандарта; одного стандарта.

Инфракрасная спектроскопия дает информацию о валентных и деформационных колебаниях атомов и молекул при поглощении света в интервале от 0,76 до ~ 1000 мкм (Приложение 12.3). Колебания связанных атомов в молекуле подразделяются на два основных типа:

·  валентные – ритмичные колебания вдоль оси связи между атомами в молекуле;

·  деформационные – колебания с изменением валентных углов связи между атомами в молекуле.

Инфракрасные спектры могут быть получены для различных агрегатных состояний веществ и используются для идентификации, количественного определения, а также для исследования строения молекул.

Каждый инфракрасный спектр характеризуется серией полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом (длиной волны) и интенсивностью максимумов поглощения. Обычно при записи спектра на оси абсцисс откладывается в линейной шкале значение волнового числа (см -1), на оси ординат - величина светопропускания Т (%).

Подготовку образцов к снятию инфракрасных спектров проводят по следующим методикам.

1. Твердые вещества

а) пасты: тщательно смешивают 10-20 мг твердого вещества с 1-2 каплями иммерсионной жидкости (вазелиновое масло, полифторуглеводород, гексахлорбутадиен и др.),

приготовленную пасту сдавливают между двумя дисками из KBr (или KCl) и помещают в спектрофотометр для измерения. Во второй канал прибора помещают слой иммерсионной жидкости между дисками, что и в первом канале;

б) диски из KBr: навеску твердого вещества (1-3 мг) тщательно смешивают в вибромельнице или ступке со спектроскопически чистым KBr (150-200 мг) и смесь прессуют. Спектр полученного образца получают относительно воздуха или диска, приготовленного из чистого КВr, помещенного во второй канал прибора. В качестве примера на рис.12.1 приведен ИК-спектр субстанции парацетамола в дисках из KBr.

Рис. 12.1 ИК-спектр субстанции парацетамола. Приготовление образца: метод диска с калия бромидом

2. Жидкие вещества

Тонкую пленку жидкости зажимают между пластинками из KBr (или KCl) или используют кюветы с малой толщиной слоя (0,01-0,05 мм). Во второй канал прибора помещают чистую пластинку KBr (или KCl) удвоенной толщины или соответствующие пустые кюветы.

3. Растворы

Раствор исследуемого образца (жидкого или твердого) в подходящем органическом растворителе (обычно используемые концентрации приблизительно 0,5-1,5%) вводят в кювету из KBr (или KCl) с толщиной слоя 0,1-1 мм. Спектр раствора снимают относительно чистого растворителя. В качестве растворителей наиболее часто применяют четыреххлористый углерод и хлороформ.

Идентификация лекарственного вещества может быть проведена путем сопоставления ИК–спектра исследуемого вещества с аналогичным спектром стандартного образца. В этом случае ИК-спектры снимают последовательно на одном и том же приборе в одинаковых условиях (агрегатное состояние образца, концентрация вещества, скорость регистрации и т. п.).

I. Примеры вопросов входного теста

Выберите один или несколько правильных ответов

1. Закон Бугера-Ламберта -Бера характеризует зависимость между поглощением:

a) полихроматического света от концентрации раствора и толщины кюветы;

b) монохроматического света от концентрации светопоглощающих частиц;

c) монохроматического света от концентрации светопоглощающих частиц и от толщины поглощающего слоя.

2. Установить соответствие между названием величин и их символами:

0)  светопропускание;