Спектральные методы в химико-токсикологическом анализе (стр. 7 )

c) длины хроматографической колонки

d) температуры

10. Жидкостная хроматография основана на теории:

а) обратимого и стехиометрического обмена ионами

b) абсорбции света

c) адсорбции вещества из раствора

d) различия в размерах молекул

11. Селективность адсорбции зависит от:

а) энергии взаимодействия между веществом и адсорбентом

b) диффузии вещества в слое сорбента

с) подвижности вещества

d) растворимости компонентов разделяемой смеси в подвижной и неподвижной фазах

12. Эффективность хроматографической колонки зависит от:

а) коэффициентов диффузии в обеих фазах

b) длины колонки

c) диаметра колонки

d) давления при вводе пробы

e) хорошей растворимости компонентов в подвижной фазе

13. Эффективность хроматографической колонки возрастает с:

а) уменьшением высоты теоретической тарелки (ТТ)

b) увеличением высоты ТТ

с) увеличением числа ТТ

d) уменьшением числа ТТ

14. Основные узлы приборов ВЭЖХ:

а) блок питания

b) колонка

с) резервуар с растворителем

d) насос высокого давления

е) секундомер

f) дозатор

g) детектор

h) термостат

15. Требования, предъявляемые к адсорбентам в ВЭЖХ:

а) селективность

b) механическая прочность

с) отсутствие глубоких пор

d) химическая инертность по отношению к разделяемой смеси

16. Детекторы, используемые в ВЭЖХ:

а) рефрактометрический

b) ИК-спектрофотометрический

с) поляриметрический

d) УФ-спектрофотометрический

е) транспортного типа

II. Лабораторная работа «Определение кислоты никотиновой методом хроматографии в тонком слое»

Материалы и оборудование:

- раствор кислоты никотиновой (0,125 г никотиновой кислоты растворяют в 2,5 мл спирта);

- стандартный образец никотиновой кислоты;

- система растворителей (подвижная фаза): гексан : этанол 95% : концентрированный аммиак в объемном соотношении 1:1:0,02;

- хроматографические камеры фирмы DESAGA H 50x50 (Приложение 14.1).

- стеклянные пластинки 50х50 мм для высокоэффективной ТСХ (например, «Silufol»).

Методика определения

1. Наполните хроматографическую камеру 1,5 мл заранее приготовленной смесью растворителей (подвижная фаза);

2. Отметьте на хроматографической пластинке с обратной стороны линию старта на расстоянии приблизительно 6 мм от края пластинки; с помощью капилляра нанесите 0,5 мкл раствора никотиновой кислоты и 0,5 мкл стандартного образца, используя шаблон.

3. Высушенную хроматографическую пластинку помещают в камеру сорбентом вниз; камеру закрывают покровным стеклом и оставляют на несколько минут для прохождения фронта растворителя на 3-4 см;

4. Извлеките пластинку из камеры, отметьте линию фронта растворителя, высушите на воздухе и рассматрите под УФ-лампой при длине волны 254 нм.

5. Обведите зоны адсорбции;

6. Определите величины Rf и Rs;

7. Сделайте вывод о соответствии определяемого токсиканта стандартному образцу по величинам Rf и Rs.

III. Лабораторная работа «Определение содержания гемцитабина в лиофилизированном порошке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)».

Гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин)– цитотоксический агент с широким спектром противоопухолевой активности, применяемый при раке поджелудочной железы, легких, яичников, молочной железы, мочевого пузыря. От качества препарата (например, соответствия его содержания количеству, заявленному в нормативной документации) зависит его эффективность и безопасность. Количественное содержание гемцитабина в лекарственных препаратах определяют методом калибровки по стандартному образцу. В качестве стандарта для проверки пригодности хроматографической системы используют дезоксицитидин - вещество, близкое по физико-химическим свойствам к исследуемому веществу (Приложение 14.2).

Материалы и оборудование:

- хроматограф с детектором для ультрафиолетового и видимого диапазонов, с термостатированием колонок, насосом краном-инжектором, например - Metrohm 844 UV/VIS Compact IC (Швейцария);

- хроматографическая колонка - PRONTOSIL С18 ace-EPS 5µ 150х4.6 (США);

- дезоксицитидин - стандарт для проверки пригодности хроматографической системы (Sigma-Aldrich, США);

- гемцитабин - лиофилизированный порошок для приготовления раствора для инъекций

- подвижная фаза: ацетатный буфер (рН 5,0):ацетонитрил в объемном соотношении 97,5:2,5; изократические условия элюирования

- скорость потока элюента - 1мл/мин

-  объём вводимой пробы - 20 мкл

-  рабочая длина волны 268 нм

Методика определения

0.  Приготовьте подвижную фазу по следующей методике:

- приготовление ацетатного буфера: 5,44 г аммония ацетата о. с.ч. растворяют в 400мл бидистилированной воды и добавляют 2,4 мл ледяной уксусной кислоты до рН 5,0

-  полученный буфер фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм, смешивают 390мл профильтрованного буфера с 10 мл ацетонитрила марки «для хроматографии»

1.  Приготовьте раствор эталонного стандарта, точно взвесив 10 мг стандартного образца гемцитабина, который затем необходимо перенести в мерную колбу емкостью 50 мл и довести до объема водой для инъекций (р-р А). Приготовте растворы эталонных стандартов для калибровки, содержащие 0,05, 0,1 и 0,15 мг/мл(точно взвесьте 2,5, 5,0 и 7,5 мг эталонного стандарта и перенесите навески в три мерные колбы емкостью 50 мл и доведите до метки водой для инъекций.

Приготовьте раствор для проверки пригодности системы: точную навеску (10мг) дезоксицитидина перенесите в мерную колбу на 50 мл, растворите в воде для инъекций, доведя объем раствора до метки и перемешайте. 40,0 мл этого раствора помещают в мерную колбу на 50 мл, содержащую 10,0 мл стандартного раствора гемцитабина(р-р А), доводят объем водой для инъекций до метки и перемешивают.

2.  Приготовление образца для анализа.

Взвешивают флакон с пробкой, затем переносят содержимое флакона в колбу на 200мл и доводят объем до метки водой для инъекций; флакон и пробку ополаскивают метанолом, дают высохнуть и снова взвешивают, рассчитывают вес взятого образца. Затем аликвоту(10мл) полученного раствора переносят в колбу на 100 мл и доводят водой до метки.

3.  При проверке хроматографической системы была получена следующая хроматограмма (рис. 14.3).

Определите тип хроматографического разделения (абсорбционная, распределительная, эксклюзивная или аффинная хроматография) и его модификацию (обращено-фазовый или нормально-фазовый вариант).

Рассчитайте и оцените параметры пригодности хроматографической системы (эффективность по показателям ЧТТ, ВЭТТ, ПВЭТТ), а также параметры разделения двух компонентов анализируемой смеси (селективность, k’, Rs).

Рис. 14.3. Хроматограмма гемцитабина (время удерживания 6,55 мин) и дезоксицитидина (время удерживания 3,89 мин).

4.  При хроматографическом определении растворов эталонных стандартов для калибровки были получены следующие данные:

Концентрация эталонного стандарта, мг/мл	АUC, mAU*c
0,05 0,1 0,15	590,77 1181,41 1773б15

Вычислите площадь пика гемцитабина анализируемого образца на полученной хроматограмме, приближенно считая пик равнобедренным треугольником: S(мм2)=а1/2•h, где а1/2 – полуширина пика (мм); h – высота пика (мм) (рис. 13.4).

По полученным результатам сделайте вывод о содержании действующего вещества в испытуемом образце и его соответствии нормативной документации. Содержание гемцитабина гидрохлорида 95-105% от величины, заявленной на этикетке (190-210 мг).

Литература

1. Материалы лекций.

2. Токсикологическая химия Под ред. . 2--е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С.186-217.

3. Основы аналитической токсикологии / Дж. и соавт.– Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1997. – С.72-76.

4. Растворители для ВЭЖХ / - М.:Бином, 2006. – 704 с.

5. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография /, , - М.: Химия, 1986. -278 с.

6. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ./Под ред. А. Хеншен. – М.: Мир, 1988. – 688с.