Основы метода жидкостной хроматографии

Жидкостная хроматография – процесс разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении компонентов смеси между двумя фазами – элюентом (подвижной фазой ПФ) и адсорбентом (неподвижной фазой НФ). Компоненты разделяемой смеси распределяются между ПФ и НФ в соответствии с их коэффициентами разделения К, определяемым по формуле:

К=с(НФ)/с(ПФ),

где с (НФ) и с(ПФ) – соответственно содержание (г/мл) компонента в обеих фазах, находящихся в динамическом равновесии.

Равновесный обмен хроматографируемого вещества между обеими фазами осуществляется в результате многократного повторения актов сорбция-десорбция по мере движения ПФ вдоль НФ внутри хроматографической колонки.

Хроматографический анализ базируется на нескольких теориях: метод теоретических тарелок и кинетическая теория хроматографии.

В методе теоретических тарелок Мартина и Синджа хроматографическая колонка теоретически делится на ряд элементарных участков – тарелок. Предполагается, что на каждой тарелке устанавливается равновесие определяемого вещества между сорбентом (НФ) и элюентом (ПФ). Каждая новая порция элюента вызывает смещение этого равновесия, вследствие чего часть вещества переносится на следующую тарелку, на которой вновь устанавливается равновесие.

Эффективность колонки тем выше, чем меньше высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) и больше число теоретических тарелок (ЧТТ) N. ЧТТ легко определить по следующей формуле:

и хроматограмме (рис. 14.2)

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Рис. 14.2. Параметры хроматографических пиков: t R – время удерживания пика; h – высота пика; W1/2 – ширина пика на половине его высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L (мкм), а также средний диаметр зерна сорбента dc (мкм), легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), а также приведенной высоты,

эквивалентной теоретической тарелке (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L / N

ПВЭТТ = BЭTT / dс

Селективность колонки α определяется отношением приведенных времен

удерживания двух пиков по следующему уравнению:

α = (tR2-t0) / (tR1-t0)

где t0 - время удерживания несорбируемого компонента; tR1 и tR2 - времена удерживания

компонентов 1 и 2.

Селективность колонки играет большую роль в достижении хроматографического разделения. Факторами, определяющими селективность разделения, являются химическая природа сорбента; состав растворителя и его модификаторов; химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси; температура колонки.

Кинетическая теория основана на кинетике хроматографического разделения и связывает ВЭТТ с процессами диффузии и установлением равновесия между двумя фазами. В основе лежит уравнение Ван-Деемтера:

H=A+B/U +CU,

где A, B и C – константы; U – скорость перемещения подвижной фазы; константа А связана с действием вихревой диффузии, которая зависит от размера частиц и плотности заполнения колонки; В – связана с коэффициентом диффузии молекул в подвижной фазе, С – характеризует кинетику процесса сорбция-десорбция, массопередачу и другие эффекты.

Важным параметром удерживания в жидкостной хроматографии является

коэффициент емкости k’, определяемый как частное от деления массы вещества в

неподвижной фазе на массу вещества в подвижной фазе:

k’. = mн / mп

Величину k' можно определить по хроматограмме:

При рассмотрении разделения двух компонентов на хроматограмме и его оценке

важным параметром является разрешение Rs, которое связывает времена выхода и

ширину пиков обоих разделяемых компонентов.

где tr,(1) и tr,(2) - времена удерживания или расстояние вдоль базисной линии от точки введения до середины основания (определяется как перпендику­ляр, опущенный от максимумов двух смежных пиков до их базисной линии); Ws (1) и Ws(2) ширина пиков.

Разрешение как параметр, характеризующий разделение пиков, увеличивается по

мере возрастания селективности адсорбции, отражаемой ростом числителя, и роста эффективности хроматографического разделения, отражаемой снижением значения знаменателя из-за уменьшения ширины пиков.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления, ВЭЖХ) является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения количественного и качественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой молекулярной массой.

ВЭЖХ является вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза - элюент - проходит через заполняющий колонку сорбент с большей скоростью за счет значительного давления на входе в хроматографическую колонку.

Основными узлами современного жидкостного хроматографа являются: насос высокого давления, дозатор, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством.

Насос высокого давления (до 200-500 атм) обеспечивает подачу элюента в колонку с заданной постоянной скоростью. В некоторых микроколоночных хроматографах применяются насосы сравнительно низкого давления (до 10-20 атм).

Хроматографические колонки из нержавеющей стали (или из стекла) длиной 10-25 см с внутренним диаметром 0,3-0,8 см (чаще 0,4-0,5 см) заполняют адсорбентом с диаметром частиц 5-10 мкм сферической или неправильной формы с помощью суспензионного метода, что дает возможность получить более равномерную и плотную упаковку частиц сорбента в колонке. Заполнение колонки проводят при давлениях выше рабочего давления в хроматографе. В микроколоночных хроматографах используются колонки меньшей длины и меньшего внутреннего диаметра (0,1-0,2 см и меньше).

Частицы адсорбента не должны разрушаться при заполнении колонки под большим давлением. Плотная упаковка частиц адсорбента малого диаметра (5-10 мкм) в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматографическое разделение компонентов смеси. Температура хроматографических колонок может поддерживаться с точностью +/-0,1 °С в интервале, ограниченном температурой замерзания и кипения элюента. Чаще всего разделение проводят в интервале температур 20-50 °С.

Детекторы в жидкостной хроматографии. Обычно используют спектрофотометрический детектор с переменной (190-900 нм) или фиксированной (чаще 254 нм) длиной волны, рефрактометрический, флуориметрический детекторы, а также детекторы транспортного типа (раствор после хроматографирования попадает на непрерывно движущуюся транспортную ленту, которая попадает в печь, где происходит испарение элюэнта; остаток на транспортной ленте испаряется в реакторе и анализируется методом ГЖХ).

Адсорбенты. Чаще всего применяют силикагель с гидроксилированной поверхностью и силикагель с привитыми к поверхности различными функциональными группами - неполярными алкильными остатками от C8 до C18 (обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ) или замещенными алкилхлорсиланами, содержащими полярные группы: нитрильная, диольная группы, аминогруппа(нормально-фазовый вариант ВЭЖХ); реже используются окись алюминия и полимерные адсорбенты. Соответственно, для неполярной неподвижной фазы используются полярные элюэнты (смеси из таких растворителей, как ацетонитрил, метанол, вода, тетрагидрофуран), а для полярной – смеси неполярных органических компонентов(например, гексан, хлороформ, дихлорэтан).

I. Примеры вопросов входного теста

Выберите один или несколько правильных ответов:

1. При скрининговых исследованиях в химико-токсикологическом анализе наиболее часто применяют следующие виды хроматографии:

a) тонкослойная

b) высокоэффективная жидкостная

c) газовая

d) ионообменная

2. Для оценки эффективности хроматографической системы используют понятие:

a) число теоретических тарелок

b) фактор удерживания

c) высота, эквивалентная теоретической тарелке

d) сорбционный коэффициент

3. Фактор удерживания Rf :

a) равен отношению расстояния от стартовой точки до середины пятна вещества к расстоянию от стартовой точки до линии фронта растворителя

b) является абсолютной характеристикой хроматограммы

c) зависит от длительности проявления

d) равен отношению расстояния от стартовой точки до линии фронта растворителя к расстоянию от стартовой точки до середины пятна вещества

4. Для хроматографического определения веществ применяют следующие типы детекторов:

a) спектрофотометрические

b) радиоактивационные

c) дифракционные

d) электрохимические

5. В качестве сорбентов в методе хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) применяют:

a) оксид алюминия

b) цианокрилат

c) полиамид

d) силикагель

6. Разделение веществ в методе ТСХ осуществляется вследствие:

a) направленного градиента концентрации жидкой фазы

b) изменения полярности вещества

c) многократного распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами

d) давления пара жидкой фазы в хроматографической камере

7. Выбор растворителя в методе ТСХ зависит от:

a) полярности растворителя

b) природы пластинки

c) активности сорбента

d) объемного соотношения компонентов смеси подвижной фазы

8. Для идентификации ксенобиотиков методом ТСХ применяют следующие реактивы:

a) реактив Марки

b) подкисленный йодоплатинат

c) нитрат ртути (II)

d) реактив Манделина

9. В методе жидкостной хроматографии мерой оценки качества разделения служит разрешение R между двумя соседними пиками, которое зависит от:

a) числа теоретических тарелок

b) скорости подачи элюента

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7