Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 10 )

При концентрировании культуральной жидкости различных микроорганизмов происходит значительное изменение минерального состава получаемого концентрата, например, при концентрировании культуральной жидкости В. mesentericus это четко видно (рис. 1.52, а).

Наиболее резко снижается содержание кальция, меди и магния, заметно уменьшается содержание цинка и марганца. Такое изменение минерального состава культуральной жидкости сказывается на стабильности ферментов в процессе концентрирования (рис. 1.52, б). При сгущении культуральной жидкости до содержания сухого вещества 10% количество кальция снижается всего на 5%, а меди - на 75%. Известно, например, что медь оказывает на ферменты ингибирующее действие, а кальций - стабилизирующее. Поэтому на первых стадиях концентрирования наблюдается повышение активности ферментов, особенно протеиназ. При более глубоком концентрировании вместе с резким снижением содержания кальция снижается активность ферментов.

Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рис. 1.50 были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 60°С и температуры греющего пара 70°С. При последующих исследованиях было установлено, что не только температура кипения концентрируемого раствора имеет большое значение, но и температура греющего пара (теплоносителя). Это отчетливо видно из рис. 1.51. Так, даже при очень низкой температуре кипения (25-30°С), происходит заметная инактивация ферментов (до 12%), если температура греющего пара равна 120°С. При температуре теплоноси°С и температуре кипения 35-40°С потери активности не превышают 10%. И еще следует отметить, что чем выше температура теплоносителя, тем больше сухих веществ концентрируемой жидкости выпадает в осадок, особенно при высоких температурах кипения (см. рис. 1.52, б).

Важно заметить, что в зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем в каждом конкретном случае.

Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние года значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительности процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубок (горизонтальным) вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10%, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.

Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60-80°С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30-40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2 • ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

1.9. МЕМБРАННЫЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ

В зависимости от движущей силы процесса мембранные методы классифицируются на диффузионные - диализ (движущая сила - разность концентраций по обе стороны мембраны), электромембранные - электродиализ (разность электрических потенциалов), баромембранные - обратный осмос, ультрафильтрация, микрофильтрация (разность давлений). Все эти процессы применяются для переработки ферментных растворов, выбор их определяется целью переработки: для очистки от низкомолекулярных примесей при небольших производительностях - диализ, для обессоливания в интенсивных условиях - электродиализ, для глубокой очистки от примесей с одновременным концентрированием - ультрафильтрация и т. д. Рассмотрим подробнее сущность и технические решения каждой группы процессов, что (дет возможность в дальнейшем выбрать оптимальный вариант для любой конкретной задачи.

1.9.1. Диализ

Диализ - это первый изученный и промышленно развитый мембранный процесс, поскольку для его осуществления не нужна сложная аппаратура и специальные мембраны. Сущность диализа в том, что если два раствора с различной концентрацией какого-либо компонента разделить мембраной, то начнется естественный процесс диффузии, достигающий равновесия при выравнивании концентраций этого компонента с обеих сторон мембраны. Интенсивность переноса вещества QВ через мембрану определяется коэффициентом диффузии этого вещества в материале мембраны DB, и пропорциональна разности концентраций ΔС. Эту зависимость можно записать в виде сравнения: QВ = DB • S • ΔС, где S - площадь мембраны.

Соответственно, чем больше различие в величинах коэффициентов диффузии двух компонентов, находящихся в растворе, тем лучше они разделяются мембраной. Понятно, что белковые молекулы (высокомолекулярные вещества) и органические и неорганические низкомолекулярные молекулы и ионы сопутствующих компонентов (сахара, аминокислоты, минеральные соли и т. п.) в силу огромных различий в коэффициентах диффузии практически полностью разделяются мембраной.

В качестве диализных мембран используют обычно пленки из целлюлозы - целлофан, купрофан, а также из других синтетических полимеров. Процесс проводят либо по проточной схеме (рис. 1.53, а), когда исходный раствор ферментов постоянно прокачивают с одной стороны мембраны, а диализирующую жидкость (обычно воду) - с другой ее стороны, либо по полупроточной схеме, когда раствор ферментов помещают на определенное время в мешочки из диализной мембраны, которые постоянно омываются водой. Таким образом можно удалить основную массу сопутствующих низкомолекулярных примесей и повысить активность ферментных растворов в пересчете на сухое вещество в несколько раз.

Процесс диализа применительно к очистке растворов ферментов имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, при диализе возможна «потеря» фермента в результате вымывания ионов металлов, входящих в состав молекулы фермента, или стабилизирующих фермент соединений, или фрагментов самого фермента, например, простетической группы его. Во-вторых, при диализе против обычной водопроводной воды может происходить потеря активности фермента в результате попадания из воды в раствор фермента ионов металлов - ингибиторов фермента. Следует также отметить, что в процессе диализа одновременно с очисткой происходит сильное разбавление ферментного раствора из-за проникновения воды под действием сил прямого осмоса в диализуемый раствор (см. рис. 1.53). Объем продиализованного раствора увеличивается примерно на 20-25%, а если учесть, что происходит активное удаление балластных веществ, то в результате диализа получают очень разбавленные ферментные растворы. Поэтому сейчас этот метод очистки ферментных растворов от балластных веществ в ферментной промышленности почти не используется. Этот метод иногда применяют в лабораторных исследованиях и при получении высокоочищенных ферментных препаратов.

1.9.2. Электродиализ

Если в процессе очистки ферментов стоит задача удалить из раствора электролитные примеси, т. е. органические и минеральные ионы, иногда пользуются электродиализом. Сущность этого мембранного метода в том, что перенос ионов через мембрану интенсифицируют с помощью постоянного электрического поля, а мембраны изготавливают из специальных ионо-обменных материалов на основе синтетических полимеров. Принципиальная схема работы электродиализаторов представлена на рис. 1.54.

Электрический потенциал к аппарату подводится через два электрода, размещенных в соответствующих электродных камерах. Обе камеры отделены от рабочей обессоливающей камеры, куда подается исходный pacтвор, ионообменными мембранами, со стороны катода - анионообменной, со стороны анода - катионообменной. При работе аппарата катионы под действием постоянного электрического поля смещаются к аноду, встречают на пути катионообменную мембрану, проходят через нее в электродную камеру и в виде слабого раствора щелочи выводятся из аппарата. Соответственно ведут себя и анионы, выходя из аппарата в виде слабого раствора кислоты. Обессоленный раствор ферментов (диализованный раствор) выводится из рабочей камеры.

Электродиализный метод осуществляется всегда в непрерывном режиме (см. рис. 1.54, б) и существенно более энергоемок, чем диализ. Применительно к обработке ферментных растворов он имеет те же недостатки. Кроме того, электродиализ нельзя применять при выделении ферментов, имеющих, например, четвертичную структуру, которая формируется с участием ионов металлов, а также при выделении металлоферментов, которые, как правило, теряют активность при электродиализе (α-амилазы, β-галактозидазы и др.).