Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 3 )

Анаэробная бактерия Clostridium felsineum продуцирует пектатрансэлиминазу, полигалактуроназу и пектинэстеразу. Четыре пектинолитических фермента обнаружены у факультативного анаэроба Bacillus polymyxa. Они характеризуются различными значениями оптимума рН и дают различные продукты гидролиза.

18. 2. 2. Протеиназы

Протеиназы, или протеазы (пептид-пептид-гидролазы), катализируют разрыв пептидных связей белков с образованием свободных аминокислот, ди - и полипептидов. Таких ферментов очень много. Некоторые из них получены в кристаллическом состоянии. По своим свойствам протеиназы микрорганизмов могут существенно различаться. Они бывают нейтральными (у Вас. subtilis, Asp. terricola), кислыми (Asp. foetidus) и щелочными, т. е. активными при различных значениях рН.

Некоторые микроорганизмы обладают несколькими протеиназами. Так, Actinomyces fradiae синтезирует шесть протеиназ. Полученный при использовании этого микроорганизма ферментный препарат «протофрадин» содержит лейцинамино - и карбоксипептидазы, сериновые протеиназы с трипсиновой, химотрипсиновой и эластазной активностями. Из культуральной среды Act. rimosus выделен комплекс протеиназ, названный «римопротелином», а из Streptomyces griseus - «протелин», гидролизующий казеин, эластин, обладающий трипсиновой, химотрипсиновой активностями и сходный с проназой.

Из Asp. terricola получен активный препарат протеиназы, лизирующий тромбы крови без гемолиза эритроцитов.

Одним из протеолитических ферментов, получаемых в промышленных количествах, является коллагеназа Clostridium histolyticum. Субстратом коллагеназы служат коллаген-белковая основа коллагеновых волокон соединительной ткани (сухожилия, сетчатый слой кожи, хрящи, связки). Пепсин, химотрипсин, трипсин, проназа отщепляют концевые пептидные группы коллагена, но не действуют на нативный коллаген.

Коллагеназа Cl. histolitycum действует на коллагены различного происхождения (шкуры животных, плавательные пузыри рыб и др.) с образованием различных продуктов, преимущественно пептидов с молекулярной массой около 500. Два трипептида доминируют в продуктах гидролиза: глицил-пролил-аланин и глицил-гистидин-пролин. Ряд грибов и Вас. subtilis образуют протеиназы, похожие на ренин животных.

Аспартаза (L-аспартат-NH3-лиаза) осуществляет разложение аспарагиновой кислоты и активно проводит ее синтез из фумаровой кислоты и аммиака. Продуцируют этот фермент Е. coli и ряд других бактерий.

Практический интерес представляют декарбоксилазы аминокислот, образуемые рядом бактерий, в частности фермент, действующий на лизин (L-лизин-карбоксилиаза).

18. 2. 3. Липазы и другие гидролазы

Из ферментов, участвующих в липидном обмене, наибольший практический интерес представляют липазы (триацилглицерол-ацилгидролазы). Продуцентами липаз, выделяемых в культуральную среду, служат многие грибы из числа Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Geotrichum, некоторые дрожжи (Candida) и бактерии (Pseudomonas). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеролов с образованием жирных кислот и глицерина.

Фосфокиназы расщепляют сложноэфирные связи между жирными кислотами, глицерином и фосфатидиловой кислотой. Они также имеют широкое распространение у микроорганизмов, особенно часто встречаются у спорообразующих бактерий рода Clostridium и Bacillus.

Пенициллинацилазы (пенициллин аминогидролазы, иначе называемые пенициллинамидазами) катализируют гидролиз пенициллина. Это имеет большое практическое значение для получения полусинтетических пенициллинов, а также инактивации антибиотика. Продуцентами ферментов являются Е. coli и некоторые другие бактерии, а также гриб Neurospora crassa. С помощью ацилаз L-аминокислот возможно разделение их на L - и D-формы, поскольку этот фермент гидролизует только ацил-L-изомер. В результате отщепления от него ацильной группы образуется L-аминокислота, которая более растворима. Продуцентами аминоациллазы, имеющими практическое значение, являются некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Аспарагиназа, образуемая в значительном количестве некоторыми штаммами Е. coli и Erwinia carotinovora, отщепляет амидную группу от аспартата, что также имеет практическое значение.

18. 2. 4. Литические ферменты

Такие ферменты способны вызывать лизис вещества клеточной стенки у многих видов бактерий и дрожжей. По действию литические ферменты микробного происхождения сходны с лизоцимом, но отличаются от него тем, что это комплекс, в состав которого могут входить α- и β-маннозидазы, глюконазы, протеиназы, амидазы, липазы, хитиназы и другие ферменты. Последовательность действия отдельных компонентов такого сложного комплекса по отношению к различным клеткам и в зависимости от продуцента различна. Протеиназы обычно действуют раньше глюконаз на клетки дрожжей, но известно, что β-1,3- и β-1,6-глюконазы Вас. subtilis лизируют дрожжевые клетки без участия протеиназ. Продуцируют литические ферменты также некоторые актиномицеты (Actinomyces griseus, Thermoactinomyces vulgaris) и бактерии из рода Pseudomonas.

18. 2. 5. Негидролитические ферменты

К негидролитическим ферментам относятся отдельные оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы, а также лигазы. Негидролитические ферменты используются в практике пока сравнительно редко.

Лактатлиазы и пектинлиазы, как уже отмечалось выше, вместе с другими ферментами осуществляют разложение пектиновых веществ. Продуцируют их бактерии родов Erwinia, Bacillus, Clostridium, а также представители некоторых грибов рода Aspergillus.

Фумарат-гидратаза, или фумараза (L-малат-гидро-лиаза), образуемая многими микроорганизмами, катализирует образование малата из фумарата и H2O. К числу бактерий, активно осуществляющих такую реакцию, относится Е. coli.

Изомеразы превращают глюкозу во фруктозу и ксилозу в ксилулозу. Продуцентами глюкозоизомеразы являются некоторые бактерии (Streptomyces и Bacillus), а также грибы из рода Мuсоr. Фермент используется для получения смеси D-глюкозы и фруктозы как заменителя сахарозы при гидролизе крахмала до глюкозы.

Глюкозооксидаза (β-D-глюкозо:O2-оксидоредуктаза) осуществляет реакцию окисления β-D-глюкозы молекулярным кислородом с образованием D-глюконо-σ-лактона и пероксида водорода. Продуцируют фермент Penicillium vitale, P. notatim и Asp. niger.

Каталаза катализирует реакцию

2 Н2О2 + 2 Н2O + О2

Фермент образуют в большом количестве грибы рода Aspergillus и Penicillium (Р. vitale), а также некоторые дрожжи и бактерии. Помимо получаемых в производственных условиях и в промышленном масштабе, имеется ряд ферментов, пока используемых в ограниченном количестве, но некоторые из них чрезвычайно важны. К их числу относятся так называемые рестриктазы (эндонуклеазы), осуществляющие расщепление нуклеиновых кислот, и лигазы, участвующие в их синтезе. И те и другие необходимы для работ в области генетической инженерии. Продуцентами таких ферментов служат различные микроорганизмы.

18. 3. ШТАММЫ-ПРОДУЦЕНТЫ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Среди выделенных из различных источников штаммов микроорганизмов найдены многие активные и производственно ценные продуценты ферментов. Однако наиболее высокопродуктивные штаммы во многих случаях получены с помощью различных физических и химических мутагенов.

18.3.1. Получение активных продуцентов

Мутанты в большинстве случаев ауксотрофны по ряду соединений, так как в них произошли определенные нарушения обмена веществ, вызвавшие гипертрофию некоторых функций клетки. Обычно активные штаммы, выявленные из естественных источников, подвергают действию мутагенов несколько раз, т. е. осуществляют ступенчатую селекцию. В результате получают высокопродуктивные штаммы. Часто эффективно комбинированное воздействие мутагенов химической и физической природы. Так, применение этиленимина и ультрафиолетового излучения в сочетании со ступенчатым отборов позволило получить очень активные штаммы Asp. awamori, используемые как продуценты амилолитического, протеолитического и других ферментных комплексов. Селекция производственно ценных штаммов ведется и в условиях производства.

Непременным условием правильно поставленного промышленного процесса являются такие мероприятия по сохранению микроорганизмов-продуцентов. Существует ряд методов хранения производственно ценных штаммов, обеспечивающих их высокую биохимическую активность (см. гл 8). В музеях живых культур при заводских лабораториях культуры периодически пересеваются. Однако пересевы через короткие промежутки времени могут снизить активность микроорганизмов, поэтому после развития культуры на плотной среде ее заливают стерильным вазелиновым маслом. Во многих случаях лучшим способом хранения является лиофилизация культур.

18. 3. 2. Питательные среды для культивирования микроорганизмов

Питательные среды по своему назначению разделяются на три основные группы: среды для поддержания штаммов-продуцентов в лаборатории и в музее, среды для получения посевного материала и среды, употребляемые в больших объемах в основном процессе производства. Если первая группа сред подбирается исходя из физиологических потребностей микроорганизмов, то две последние группы должны удовлетворять и требованиям производства, т. е. они должны быть достаточно дешевыми. Состав сред, обеспечивающих накопление того или иного фермента, может значительно отличаться от состава сред, применяемых для выделения и поддержания культуры продуцентов.

Как уже было отмечено выше, некоторые ферменты микроорганизмов индуцибельны и требуют для своего синтеза присутствия в среде индуктора, причем индуктором не всегда может быть субстрат, на который фермент действует. Так, например, если для синтеза липазы Aps. niger благоприятно присутствие в среде растительного масла, а для синтеза рибонуклеазы - нуклеиновых кислот, то для повышенного синтеза α-амилазы Вас. polymyxa недостаточно присутствия в среде растворимого крахмала, необходимо добавление гидролизата казеина. При замене органических соединений азота неорганическими фермент не синтезировался. С целью удешевления производства ферментов подбирают наиболее дешевые источники сырья, пригодные для культивирования микроорганизмов-продуцентов