Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 25 )

Бактерии расщепляют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Фруктоза сбраживается по типу гетероферментативного молочно-кислого брожения с образованием молочной и уксусной кислот, маннита и СО2. Глюкоза полимеризуется в декстран. Процесс идет быстро и продукт можно выделить уже через 24 ч.

Декстран выделяют из культуральной жидкости, например, метанолом. Можно, используя определенные приемы, осаждать фракции клинического декстрана с молекулярной массой 60-80 тыс. даже из смеси декстранов разной молекулярной массы. Можно осадить весь продукт, растворить его в воде и изолировать требуемый декстран фракционированием. При необходимости выделенный декстран деполимеризуют (ферментативно, термической обработкой или ультразвуком). Для очистки декстран неоднократно растворяют в воде, переосаждают метанолом и фракционируют.

Поскольку декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду и синтез полимера идет вне клетки, декстраны получают и ферментативным путем. Для этого продуцент выращивается в условиях, обеспечивающих наиболее высокую активность внеклеточного ферментного комплекса. В период максимальной активности декстрансахаразы культуральную жидкость отделяют от клеток и консервируют, снижая значение рН до 5,0-5,2. При такой кислотности и температуре около 15 °С декстрансахараза, содержащаяся в культуральной жидкости, сохраняет активность не менее месяца. В СССР разработана технология получения частично очищенной декстрансахаразы. Ферментационная среда должна содержать сахарозу и декстран-«затравку». Процесс синтеза продолжается около 8 ч. Ферментативный способ удобнее микробиологического, так как он поддается более надежному контролю и регулированию, позволяет одним только варьированием исходных концентраций сахарозы и фермента, а также температуры процесса сразу получать декстран необходимой молекулярной массы. Это значительно упрощает и удешевляет последующие технологические операции. Широкое применение в промышленности может найти использование иммобилизованных декстрансахараз.

В нашей стране в 1983 г. выпущена первая промышленная серия конъюгатов модифицированного декстрана со стрептокиназой - «стрептодеказа» - пролонгированная с помощью декстрана форма стрептокиназы.

Ксантан, продуцируемый Xanthomonas campestris, выпускают под названиями: биополимер Хс, келцан, ксантан, келтрол. Бактерии культивируют на среде, содержащей 1-5 % углеводов (кукурузный крахмал, сахар-сырец, меласса и др.), органическое соединение азота, двузамещенный фосфорнокислый калий и микроэлементы, рН среды 6,5-7,2. Инкубацию проводят в аэробных условиях, при 28 °С, в течение 72 ч. Для улучшения свойств полисахарида к среде во время ферментации добавляют формальдегид. Добавка позволяет получать гликан с повышенной устойчивостью к различным неблагоприятным факторам, в том числе к температуре и засолению. Полимер используют в виде раствора вязкой культуральной жидкости или в виде порошка, высушенного в струе горячего воздуха. В последнем случае полисахарид отделяют от клеток центрифугированием и очищают осаждением этанолом, метанолом или ацетоном в присутствии электролита.

Интенсивные поиски продуцентов полисахаридов типа ксантана ведутся в различных странах. Активные продуценты среди бактерий рода Xanthomonas найдены в Советском Союзе. Разрабатывается технология получения отечественного ксантана в промышленном масштабе.

Нередко нативные полисахариды не обладают желаемыми качествами. Они могут быть, например, недостаточно активны или, будучи высокоэффективными, плохо растворимы или токсичны, что препятствует их применению, и т. д. Чтобы улучшить действие полисахаридных препаратов, устранить или снизить нежелательные явления, т. е. получить препарат с нужными свойствами, выделенные полисахариды иногда подвергают химической модификации. Так, декстран сульфатируют, чтобы придать ему антикоагулирующую активность. Обработка нативного гликана A. faecalis var. myxogenes солюбилизирующими агентами позволяет получить производные, образующие гели без предварительного нагревания. Растворимость глюкана A. pullulans и маннана R. rubra удается повысить карбоксиметилированием. Снижение токсичности противоопухолевого препарата белково-липо-полисахаридного комплекса из культуральной жидкости Serratia piscatorum достигается обработкой его щелочью. Получение производных полисахаридов связано с дополнительными технологическими операциями.

Все более широкое применение для производства экзогликанов находит метод непрерывного культивирования продуцентов. С его помощью в ряде стран уже получают многие перспективные в практическом отношении полисахариды (ксантан, курдлан и др.). Этот способ весьма эффективен и экономичен, поскольку позволяет длительно получать продукт в период его максимального накопления и наиболее полно использовать субстрат. Подсчитано, что процент конверсии углеродного субстрата в экзополисахариды при проточном культивировании в 2-3 раза выше, чем при периодическом. Обычно в качестве лимитирующего фактора в хемостате используют азот, а также фосфор и серу. Это обеспечивает интенсивное накопление экзогликанов. Благодаря правильному подбору условий ксантан получают при непрерывном культивировании продуцента в течение многих сотен часов.

В настоящее время разрабатывается производство ряда других практически ценных полисахаридов. У нас в стране на опытной установке Красноярского завода медпрепаратов получают аубазидан и суспензии сульфата бария на аубазидане. Создается опытно-промышленная установка для наработки маннана, развиваются работы по получению продигиозана и группоспецифических полисахаридов менингококков (вакцин).

Перед микробиологическим производством полисахаридов стоит ряд задач. Одна из важнейших - замена дорогостоящих сахаров - традиционного источника углерода для получения многих полисахаридов, более дешевым сырьем. В связи с этим ведутся поиски микроорганизмов, растущих и образующих полисахариды при использовании углеводородов, этанола, метанола. Спирты как источники углерода несомненно удобнее углеводородов, так как они хорошо растворимы в воде, что значительно упрощает технологию выделения и очистки продукта. Использование для культивирования микроорганизмов возможно более простых по составу сред - синтетических или диализованных, необходимо при получении высокоочищенных антигенов. Дешевый субстрат - гидролизат торфа - предлагается использовать для производства пуллулана.

Необходимы поиск новых продуцентов полисахаридов с полезными свойствами, особенно внеклеточных, и селекционно-генетические исследования перспективных микроорганизмов с целью получения вариантов с повышенной продуктивностью гликанов. Метод экспериментальной селекции активных штаммов нередко оказывается более быстрым и экономичным в сравнении с поиском таковых в природных условиях. Так, в результате действия низкой температуры с последующим облучением быстрыми нейтронами удалось отобрать варианты X. campestris, обладающие повышенным синтезом ксантана.

Поскольку микроорганизмы являются поистине неиссякаемыми источниками полисахаридов, можно не сомневаться, что среди этих полимеров будут обнаруживаться вещества, оригинальные в химическом отношении и представляющие большую ценность для практики.

10. ПОЛУЧЕНИЕ ЖИРА И ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ

Витамины - группа низкомолекулярных органических веществ, которые в очень низких концентрациях оказывают сильное и разнообразное биологическое действие. В природе источником витаминов являются главным образом растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение. Микробиологическим путем получают эргостерин, витамин B12. Кроме того, микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу (при получении витамина С), а также для производства витаминных концентратов (витамина В2, каротиноидов).

Перспективно микробиологическое получение биотина, используемого в рационе кур и свиней. В настоящее время на Западе в большую часть комбикормов для свиней включают биотин, получаемый путем химического синтеза. В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь, а биологической активностью обладает лишь D-форма витамина, которую синтезируют микроорганизмы.

В мире существует 40 крупных промышленных производителей витаминов; 18 из них в США, 8 - в Японии, 14 - в Западной Европе Ведущее место в производстве витаминов занимает швейцарский концерн Hoffman La Roche, выпускающий 50-70% всех витаминов.

12. 3. 4. Получение и применение эргостерина

В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.

Дрожжи, а также грибы рода Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D2 или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи.

Максимум поглощения эргостерина отмечен при 280 нм. Именно это излучение возбуждает отдельные связи колец А и В в молекуле эргостерина и вызывает его превращение в витамин D2. Облучение производят ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280-300 нм (сухие дрожжи) или в тонком слое 5 %-ной суспензии дрожжей. При более коротковолновом и длинноволновом излучении повышается выход других соединений стериновой природы.

На выход витамина D2 (и образование других соединений) оказывают влияние длительность облучения, температура, наличие примесей. Поэтому облучение эргостерина, используемого в качестве пищевых добавок, производят с большой осторожностью.

Промышленность СССР выпускает препарат под названием «Кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D2». В 1 г абсолютно сухих дрожжей содержится 5000 ИЕ витамина D2, не менее 46 % сырого белка и незаменимые аминокислоты, в том числе лизин, метионин, триптофан.

Для получения кристаллического витамина D2 дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110 °С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78 °С и после охлаждения до 10-15 °С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В.