Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 14 )

Процесс выделения и очистки антибиотиков представляет собой сложный технологический процесс. Малая стабильность многих антибиотиков и возможность потери их активности при химических превращениях привели к преимущественному использованию для выделения и очистки антибиотиков физико-химических приемов разделения веществ, включая сорбцию, экстракцию и кристаллизацию, т. е. таких процессов, которые не сопровождались резким химическим воздействием на молекулу антибиотика.

Для разделения, выделения и очистки антибиотиков применяются как равновесные, так и кинетические методы. Однако для производственных задач равновесные методы оказались более экономически выгодными и эффективными. Наибольшее значение приобрели здесь сорбционные и экстракционные методы. Равновесные методы могут быть одностадийными и многостадийными. При промышленном применении, а также при изучении свойств антибиотиков имеют большое значение многостадийные процессы, позволяющие значительно улучшать степень чистоты выделяемого препарата.

Предварительная обработка и фильтрация культуральных жидкостей антибиотиков. Предварительная обработка культуральной жидкости и удаление мицелиальной массы являются первой стадией перед выделением и очисткой. Собственно, уже на этой стадии начинается частичная очистка культуральной жидкости от примесей. В зависимости от свойств антибиотика и методов его выделения и очистки выбирается способ предварительной обработки культуральной жидкости. Основной задачей предварительной обработки культуральной жидкости является получение нативного раствора (а в случае нахождения антибиотика в мицелии - мицелиальной массы) с наибольшей степенью чистоты, с наименьшими потерями, позволяющими обеспечить успешное проведение дальнейших операций выделения и химической очистки антибиотика. Большинство антибиотиков выделяются и очищаются из нативного раствора тремя методами: 1) экстракционным, 2) ионообменным, 3) осаждением нерастворимого соединения. При экстракционном методе извлечения антибиотиков из жидкости (пенициллин, эритромицин, новобиоцин) нативный раствор при предварительной обработке должен быть максимально освобожден от примесей, способных образовывать стойкие эмульсии с органическим растворителем. Белковые примеси, как правило, вызывающие образование стойких эмульсий, удаляются или вместе с мицелием с помощью различных химических способов или нагревом жидкости, или тем и другим вместе. Если мицелиальная масса удаляется легко без предварительной обработки, то к нативному раствору добавляют дезэмульгаторы, удерживающие белковые вещества в растворенном состоянии в условиях экстракции. При выделении и очистке пенициллина в качестве дезэмульгатора используется «контакт Петрова» (керосиновый контакт, катексол, ультравет, цетазол). При выделении и очистке эритромицина необходимо удалять из нативного раствора ионы кальция, которые могут при экстракции способствовать выпадению антибиотика в осадок.

В случае применения ионообменного метода выделения антибиотика из нативного раствора последний должен быть максимально освобожден от конкурирующих ионов в случае сорбции на катионитах ионов кальция, магния, железа. Для удаления кальция применяется щавелевая кислота, для удаления магния - фосфаты, для удаления железа - желтая кровяная соль. Если антибиотик выделяется из нативного раствора с помощью осаждения, то из нативного раствора желательно удалить все примеси, способные в этих условиях перейти в осадок.

Одной из основных задач предварительной обработки культуральной жидкости является коагуляция частиц, находящихся во взвешенном состоянии. Особенно важность этой задачи проявляется при коагуляции и фильтрации культуральной жидкости актиномицетного происхождения или бактериального. Отделение мицелиальной массы от нативного раствора в большинстве случаев связано со значительными трудностями. Это объясняется спецификой осадка, который обычно имеет аморфный, слизистый, бесструктурный характер и быстро забивает поры фильтрующего материала. Большое влияние на процесс фильтрации оказывают качество сырья и сырьевой состав питательной среды. Например, применение соевой муки, жмыхов в составе среды ухудшает фильтрацию жидкости. Применение гидрола вместо глюкозы как источника углевода снижает скорость фильтрации (производство стрептомицина). Неполное потребление питательных веществ, применение жировых пеногасителей на последних этапах ферментации также приводят к ухудшению фильтрации. Для улучшения процесса фильтрации очень важно вовремя прекращать процесс ферментации. Прекращать ферментацию желательно при полном потреблении углеводов, но до наступления разрушения микробной клетки, так как процесс фильтрации автолизированной культуры обычно идет плохо. Кроме того, увеличение длительности ферментации ухудшает качество нативного раствора, увеличивает его пигментацию, содержание белковых примесей. Для коагуляции культуральные жидкости антибиотиков специально обрабатываются. В зависимости от свойства антибиотика, происхождения мицелиальной массы и метода выделения и очистки антибиотика культуральная жидкость для улучшения фильтруемости обрабатывается: 1) кислотной коагуляцией; 2) введением в жидкость электролитов; 3) тепловой коагуляцией; 4) применением наполнителей; 5) образованием наполнителя непосредственно в жидкости. Иногда используется сочетание двух методов. Кислотная и тепловая коагуляция используется в том случае, если антибиотики устойчивы при изменении рН раствора и температуры. Нагревание жидкости увеличивает скорость фильтрации вследствие свертывания и коагуляции белков при высокой температуре, а также благодаря значительному уменьшению вязкости фильтрата. С другой стороны, тепловая коагуляция увеличивает пигментацию нативного раствора и тем самым может ухудшить качество готового продукта.

Для улучшения фильтрации часто применяются наполнители такие, как диатомит или инфузорная земля, перлит и т, д. Хорошим методом коагуляции культуральных жидкостей антибиотиков является метод образования наполнителя непосредственно в жидкости при добавлении реагентов, образующих в ней нерастворимый осадок. Выпадающий в жидкости осадок предотвращает слипание частиц мицелия, способствует образованию гранул, благодаря чему мицелий приобретает комковатую структуру и образует при фильтрации хорошо проницаемый слой. Эффективность этого метода высока и при правильной выборе условий позволяет увеличить скорость фильтрации в 3 - 10 раз (рис. 18).

Исключительно большое влияние на эффективность коагуляции культуральной жидкости оказывают гидродинамические условия процесса. Культуральные жидкости, обработанные при разных гидродинамических режимах, отличаются по внешнему виду. Обработка при слабом перемешивании позволяет получать осадки в виде маленьких комочков, хорошо фильтруемые. С усилением перемешивания коагуляция становится менее отчетливой, жидкость отстаивается медленнее. Осадки после фильтрации получаются более влажными, липкими. Гидродинамические условия при обработке культуральных жидкостей оказывают большое влияяние на фильтруемость их. Так, например, при увеличении скорости фильтрации культуральной жидкости от 1 до 2 м/сек фильтруемость суспензии и степень ее дисперсности практически одинаковы. Дальнейшая интенсификация гидродинамического режима (до ω = 10 м/сек) приводит к ухудшению фильтрационных характеристик суспензии. Следовательно, при фильтрации культуральных жидкостей имеет большое значение не размер кристаллов, а величина гранул, которые образуются при агрегации частиц коагулянта-наполнителя и мицелия. Большое значение для фильтрации коагулированного раствора имеет продолжительность выдержки после обработки. Уменьшение выдержки ниже определенного предела вызывает снижение скорости фильтрации и может в некоторых случаях привести к опалесценции фильтрата. Движущей силой процесса фильтрации является разность давлений по обе стороны слоя осадка, а одной из важнейших характеристик его - скорость фильтрации, т. е. количество фильтрата, получаемого с единицы поверхности в единицу времени. Скорость фильтрации зависит от давления, толщины слоя осадка, структуры и характера осажденного вещества, вязкости жидкой фазы суспензии и других факторов.

Экстракционные процессы. Экстракция широко применяется для выделения и очистки многих химических соединений, в том числе и антибиотиков (и, особенно, когда они - или продукты их соединения с переносчиками не ионизированы в водной фазе). Несмотря на существенный недостаток экстракционных процессов, а именно использование вредных, взрывоопасных органических растворителей, все же она находит широкое применение в промышленности. Во-первых, экстракционные процессы по времени протекают значительно быстрее, чем ионообменные, коэффициенты распределения для некоторых систем очень велики, и это позволяет резко сокращать объемы перерабатываемых растворов. Аппаратурно этот процесс очень легко осуществить непрерывным способом. Особенно интересна экстракция с переносчиком; часто этот вид экстракции называют жидким ионным обменом.

Экстракция с переносчиком. Перенос вещества осуществляется е образованием комплексного соединения с гидрофобным переносчиком. Перенос осуществляется не только за счет переносчика, но и за счет подавления полярных групп в молекуле антибиотика переносчиком. В качестве переносчиков используются (олеиновая кислота, ундециленовая кислота, из оснований - цетазол (цетилпиридиний бромид). Кислота (например, олеиновая) взаимодействует с основанием стрептомицина, образуя соль с большей энергией сольватации в органической фазе, и вещество переходит в органическую фазу. Переносчик может находиться как в водной, так и в органической фазе. Случай, когда переносчик находится в водной фазе, экстракцию можно представить следующим образом:

А+В ↔ (АВ′) р-р водный ↔ (АВ) органическая фаза (1)

Переносчик находится в органической фазе:

А+ + В-С+ ↔ А+В- + С+ (2)

Компонент В неспособен находиться в водной фазе. В этом случае мы имеем уравнение ионного обмена, и к нему можно применить все законы ионного обмена. Таким образом, если перенос осуществляется с помощью неионизированного переносчика, то используется уравнение (2), а если переносчик ионизирован, то уравнение (1).