Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 2 )

Гриб Malbranchea pulchella var. sulfurica, способный расти при 45°С, выделяет в среду термостабильную протеиназу, сохраняющую активность при 73°С.

Некоторые мезофильные микроорганизмы также образуют ферменты с высокой термостабильностью, проявляющие максимальную активность при более высокой температуре, чем нужна для роста продуцента.

Необычна форма жизни галофильных микроорганизмов, рост их наблюдается даже в насыщенном растворе NaCl. Ферменты таких микроорганизмов требуют для проявления максимальной активности высоких концентраций солей. Отношения микробных ферментов к кислотности и щелочности среды во многих случаях также уникальны.

Амилолитическая активность Aspergillus niger обеспечивается двумя амилазами, из которых одна стабильна при очень низких значениях рН.

Некоторые амилазы, напротив, требуют для проявления активности резко щелочных условий. Например, амилаза Bacillus sp. проявляла максимум активности при рН 10,5. Известны бактерии, развивающиеся в щелочной среде (рН 9,0 и выше) и образующие ферменты с высоким оптимумом рН.

Большой интерес как продуценты ферментов представляют анаэробные микроорганизмы. Многие анаэробные бактерии превращают аминокислоты, пурины, пиримидины и другие субстраты путями, отличными от тех, которые известны для аэробных микроорганизмов, животных и растений.

В последние годы установлено, что среди строгих анаэробов имеются бактерии, способные расти в хемолитоавтотрофных условиях. При этом у них действуют системы ассимиляции углекислоты, не свойственные другим организмам, что обусловлено наличием особых ферментов. К числу таких автотрофов принадлежат некоторые метанобразующие, ацетатобразующие и сульфатредуцирующие бактерии.

Внимание, проявляемое к анаэробам, объясняется возможностью получения в результате их деятельности этанола, бутанола, метана, ацетата и других полезных продуктов при переработке растительных остатков и другого дешевого сырья. Культивирование анаэробов исключает необходимость аэрирования и перемешивания питательной среды; снижается возможность инфицирования, вызываемого недостаточной стерильностью воздуха. Кроме того, использование анаэробных микроорганизмов позволяет проводить процесс в больших емкостях с высоким слоем среды.

Свойством многих ферментов микробного происхождения является их индуцибельность. Так, синтез β-галактозидазы у Escherichia coli индуцируется лактозой и начинается менее чем через три минуты после ее внесения, а при удалении индуктора синтез так же быстро прекращается. Поэтому путем изменения условий культивирования можно добиться образования микроорганизмами больших количеств многих практически важных ферментов.

Известно, что ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но полученные из разных организмов, могут существенно различаться по свойствам. Примером этого может служить глутаминаза, осуществляющая дезамидирование глутамина с образованием глутаминовой кислоты. У глутаминаз, полученных из клеток Azotobacter agilis, оптимум рН = 6,0 - 7,0; из Clostridium welchii - 5,0; из Mycobacterium tuberculosis - 8,3. Хлориды ингибируют глутаминазу Pseudomonas sp., но не влияют на ее активность у Е. coli и активируют глутаминазу Cl. welchii. Аспарагиназы Е. coli и Alcaligenes euirophus различны по субстратной специфичности.

Резюмируя сказанное, следует подчеркнуть, что микроорганизмы обладают очень высокой активностью ферментативных реакций и способны осуществлять многие процессы, отсутствующие у макроорганизмов, благодаря наличию специфических ферментов.

Ферменты сходной функции у микро - и макроорганизмов могут быть различны по свойствам и у микроорганизмов иногда для проявления своей активности нуждаются в особых условиях. Поэтому изучение ферментов разных микроорганизмов - задача весьма важная.

18.2. ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ

В своей практической деятельности человек использует ферментативную активность микроорганизмов очень давно. Культуры грибов уже несколько тысяч лет назад в Китае, Корее, Японии и некоторых других странах применяли для осахаривания крахмалистых продуктов и для получения спирта.

Винокурение, хлебопечение, обработка волокнистых растений, получение кисломолочных продувов известны человечеству с давних времен. Однако использование не ферментной активности микроорганизмов, а собственно ферментов как индивидуальных химических соединений специфического и сложного строения началось сравнительно недавно. Ферменты в промышленных масштабах производятся в ССС, Японии, США, Англии, Франции, Голландии, Дании, Швейцарии, Чехословакии, Венгрии, Польше и ряде других стран.

Основными поставщиками ферментов из микроорганизмов до последнего времени были грибы. Однако сейчас все более широкое применение находят ферменты и некоторых бактерий (табл. 18.1).

Согласно принятой системе классификации все ферменты подразделяют на шесть классов. 1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтетазы).

Наиболее широкое применение получили ферменты микроорганизмов, относящиеся в гидролазам (гликозидазы, пептидазы и др.). Они воздействуют на глюкозидные, пептидные, эфирные и некоторые другие связи с участием воды:

XY+HOH→XH+YOH

Среди гидролаз много внеклеточных ферментов. Выделяясь из клеток, они накапливаются в культуральной среде. Получение таких ферментов, как уже отмечалось, проще и дешевле, чем выделение из клеток. Поэтому гидролазы представляют особый интерес и наиболее часто используются.

18. 2. 1. Гликозидазы

К гликозидазам относится большое число микробных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных соединений. Изучаются и применяются они давно. В эту группу входят амилолитические ферменты, гидролизующие крахмал: α- и β-амилазы и глюкоамилаза. Эти гидролазы в зависимости от происхождения (животные, растения, грибы, бактерии) различаются по строению, молекулярным массам, термостабильности, оптимуму рН и другим свойствам. Многие микроорганизмы образуют α-амилазу (1,4-α-D-глюканглюканогидролазу), гидролизующую внутренние α-1,4-глюкозидные связи в амилазе и амилопектине с образованием мальтозы, декстранов и небольшого количества глюкозы. Синтез β-амилазы у микроорганизмов наблюдается реже.

Продуцентами α-амилазы, применяемыми в практических целях, являются Bacillus licheniformis, Вас. amyloliquefaciens, Aspergiellus oryzae и некоторые другие микроорганизмы. Интересен тот факт, что α-амилаза Вас. licheniformis обладает очень высокой термоустойчивостью и способна гидролизовать крахмал при температуре около 100°С.

Широко представлена, в основном у грибов, глюкоамилаза (1,4- α-D-глюкан-глюканогидролаза). У Asp. niger она состоит из двух глюкопротеинов с молекулярной массой около 100000 дальтон.

Декстраназа (1,6- α-D-глюкан-глюканогидролаза) воздействует на 1,6-глюкозидные связи в декстране. В большом количестве ее образуют Penicillium purpurogenium и некоторые другие грибы этого рода.

Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогидролаза) гидролизует грибной полисахарид пуллулан, а также гликоген, аминопектин и декстрины, последние образуются из амилопектина и гликогена. Интересно, что фермент пуллуланаза получают из грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, редко используемой в качестве продуцента ферментов.

Лактаза или β-галактозидаза (β - D-галактозид-галактогидролаза) превращает лактазу в глюкозу и галактозу. Продуцируют фермент Е. coli, Asp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Curvularia inaqualis, Alternaria tenuis и некоторые другие микроорганизмы.

Инвертаза (β-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Образуют ее многие представители рода Aspergillus (Asp. awamori, Asp. batatae, Asp. niger), дрожжи, а также отдельные штаммы Bacillus subtilis и Вас. diastaticus.

Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) - сложный комплекс активных белков, действующих на различные участки молекул целлюлозы. С1-компонент (экзонуклеаза) действует на нативную целлюлозу (хлопок, фильтровальная бумага); Сx-компонент (эндонуклеаза) гидролизует клетчатку, переведенную в растворимую форму (карбоксиметилцеллюлозу). Вместе с целлюлазами микроорганизмы продуцируют целлобиазу (β-глюкозидаза), гидролизующую целлобиозу, и гемицеллюлазу, действующую на гемицеллюлозу. В конечном счете гидролиз целлюлозы приводит к образованию глюкозы.

Выпускаемые промышленностью препараты целлюлолитических ферментов обычно обладают активностью С, и Сx, а также целлобиазной и гемицеллюлазной активностями; эти препараты стабильны в широком диапазоне рН (от 3,0 до 8,0). Продуцентами целлюлаз являются многие мицелиальные грибы, в том числе Penicillium notatum, P. variabile, P. iriense, Trichoderma roseum, Verticillium alboatrum и др. Продуцируют целлюлазы и некоторые бактерии, но их свойства изучены мало.

Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Пектины (полигалактурониды) состоят из остатков D-галактуроновых кислот, соединенных α-1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом.

Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Пектиназы (полигалактуроназы) широко распространены у микроорганизмов (грибов и бактерий); у растений они встречаются редко.

Известны ферменты, осуществляющие негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между С4 и C5. Грибные пектолитические ферменты имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0; они более стабильны. Некоторые фитопатогенные грибы обладают высокоактивным пектолитическим комплексом ферментов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum forma lycopersici), обусловливающим их патогенность. Фитопатогенные виды Erwinia вызывают распад тканей ряда растений благодаря высокой активности пектинолитических ферментов.