Выделение и очистка продуктов биотехнологии (стр. 20 )

Процесс получения липидов на гидролизатах верхового торфа малой степени разложения включает несколько основных операций: получение гидролизата торфа, отдувка фурфурола и нейтрализация гидролизата до рН 5,5-6,0, введение в гидролизат минеральных источников питания, выращивание дрожжей - продуцентов липидов, отделение биомассы и экстракция из нее липидов. Следовательно, весь процесс аналогичен процессу получения кормовых дрожжей, за исключением дополнительных операций, связанных с извлечением липидов. Система растворителей, применяемая для этой цели, идентична используемым в масло-жировой промышленности. Оставшаяся после экстракции липидов биомасса «биошрот» может быть использована в кормлении сельскохозяйственных животных.

Продуцентами липидов на гидролизатах торфа являются выделенные в институте микробиологии АН БССР штаммы Lipomyces lipoferus, биомасса которых содержит до 40 % липидов и более. Из одной тонны абсолютно сухого торфа можно получить 50-70 кг дрожжевых липидов, содержащих до 70-75 % триацилглицеринов.

Кроме гидролизатов торфа для культивирования липидообразующих дрожжей и получения липидов по указанной выше схеме могут быть использованы другие гидролизные среды, например, гидролизаты древесины, или смешанные субстраты древесины и торфа.

19. 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПИДОВ

Многочисленными экспериментами показано, что дрожжевые липиды и продукты их переработки могут использоваться в самых различных отраслях народного хозяйства: в текстильной, керамической, кожевенной, металлообрабатывающей (прокат стального листа, протяжка проволоки, лужение жести) промышленностях. Дрожжевые липиды могут быть использованы также при производстве каучука, резины, фармацевтических препаратов, косметики, мыла, олиф, в процессах флотации руд и др. Наконец, как показали эксперименты, дрожжевые липиды могут найти большое применение в кормлении сельскохозяйственных животных и птиц. В этом случае из схемы производства липидов исключается процесс их экстракции из клеток - для кормовых целей используется богатая жиром биомасса микроорганизмов.

После второй мировой войны значительное число работ было направлено на изыскание возможности получения микробных липидов для пищевых целей. Шведский исследователь Лундин показал, что богатый физиологически необходимыми жирными кислотами дрожжевой жир (Rhodotocula gracilis) может с успехом использоваться кроме технических и на пищевые нужды. Рацион из 25 г жировых дрожжей может обеспечить организм человека 10 г липидов, 6 г белка и многими другими необходимыми веществами, что на 20 % удовлетворяет дневную потребность в этих соединениях.

Производство микробного жира для пищевых целей уже имело место в Германии во время первой мировой войны. В качестве питательной среды использовали мелассу или другие сахарсодержащие субстраты, продуцентом служил дрожжеподобный гриб Endomycopsis vernalis. В пищу использовали богатую жиром биомассу, из которой готовили пасту, известную под названием «Эвернал» или «Мицета».

Комбинируя питательные среды, а также подбирая продуцент и условия его культивирования, можно получать липиды, по составу отвечающие требованиям различных отраслей промышленности и сельского хозяйства. Например, при кормлении птиц предпочтение отдается липидам, содержащим до 65-70% ненасыщенных жирных кислот. Микробные липиды, содержащие значительное количество жирных кислот с двумя двойными связями, возможно использовать для приготовления лаков и красок, а также для приготовления медицинских препаратов, способствующих предотвращению атеросклероза и тромбоза. Липиды с преобладанием насыщенных жирных кислот можно употреблять на производство технических смазок. В первых случаях таким требованиям отвечают липиды мицелиальных грибов и дрожжей Lipomyces lipoferus, а во втором - липиды Candida humicola, выращенных на гидролизате древесины.

Резюмируя сказанное, следует отметить, что состав липидов (а отсюда и область их возможного использования) в большой мере обусловлен систематическим положением организма-продуцента. В то же время соотношение отдельных компонентов в составе липидов определяется спецификой используемого сырья и физико-химическими условиями культивирования. Эти закономерности липидогенеза весьма существенны при организации промышленного производства микробного жира, так как в конкретных условиях позволяют получать продукт строго определенного состава и свойств. Такой управляемый микробный синтез может удовлетворить требованиям, предъявляемым к липидам различными отраслями народного хозяйства.

8 . ПОЛУЧЕНИЕ НУКЛЕАТИДОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Микробиологический синтез нуклеотидов и их производных имеет пока довольно ограниченные масштабы. Сферы применения этих соединений также пока невелики, за исключением нуклеотидов, используемых как вкусовые пищевые добавки, в особенности при производстве искусственной пищи. Нуклеотиды и их производные могут иметь применение и как лечебные препараты. Широко используются они в лабораторной биохимической практике. Характерная особенность большинства способов получения нуклеотидов - необходимость внесения метаболического предшественника в среду для культивирования микроорганизмов или в реакционную смесь.

17.1. СИНТЕЗ АТФ

Получение аденозинтрифосфата (АДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ) основано на осуществлении культурой микроорганизма реакции фосфорилирования аденина или адениловой кислоты (5'-АМФ).

В случае использования Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 эту бактерию выращивают на среде, содержащей высокую концентрацию глюкозы, мочевину, дрожжевой экстракт, соли фосфора, магния, кальция и биотин. По ходу культивирования в среду вносят аденозан, который подвергается ферментативному фосфорилированию с образованием адениловой кислоты, АДФ и АТФ. При аналогичных условиях культивирования, но при внесении гуанозина можно получить гуаниловую кислоту, ГДФ и ГТФ. Фосфорилирующим агентом, по-видимому, выступает АТФ. Накопить АТФ в сфере реакции без передачи на акцепторную молекулу внесенного из вне аденозина не удается.

Другим источником ферментных систем, осуществляющих фосфорилирование 5'-АМФ, могут служить пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), взятые в виде гомогената или ацетонового порошка. Реакционная смесь содержит 5'-АМФ, глюкозу, фосфатный буфер (рН 7,0) и дрожжи, подготовленные, как сказано выше (рис. 17.1). Вслед за истощением глюкозы при минимальном количестве неорганического фосфата отмечается максимум накопления АТФ. После достижения максимума АТФ наблюдается его распад до АДФ и АМФ при одновременном повышении уровня неорганического фосфата. На выход продукта существенное влияние оказывает концентрация фосфата, присутствующего в виде фосфатного буфера. Отклонение от оптимальной величины может привести к ряду нежелательных реакций: вызвать образование инозиновой кислоты, инозина и гипоксантина. Вероятно, вносимый извне аденозин необходим для осуществления «затравочной» реакции. В равной мере это относится и к 5'-АМФ. Отсюда очевидна необходимость иметь в сфере реакции высокую концентрацию глюкозы, и сбалансированное количество фосфата.

По несколько иному пути происходит синтез АТФ при введении в среду аденина (вместо аденозина). В этом случае ключевой реакцией является N-рибозидация аденина. Процесс обычно проводят как типичную аэробную ферментацию с добавлением предшественника. Продуцентами служат Brevibacterium ammoniagenes или Corynebacterium sp. В этих случаях также необходима среда с высокой концентрацией глюкозы. На первом 1 этапе синтеза происходит образование АМФ из внесенного в конце экспоненциальной фазы роста культуры аденина и синтезированного клеткой фосфорибозилпирофосфата (ФРФФ). Реакцию осуществляет аденинфосфорибозилтрансфераза:

Дальнейший процесс происходит так же, как при наличии АМФ ФРФФ в клетках образуется в результате реакции, происходящей между рибозо-5-фосфатом (Р-5-Ф) и АТФ при посредстве АТФ: D-рибоза-5-фосфат пирофосфаттрансферазы. АТФ и Р-5-Ф образуются в результате катаболизма глюкозы. Р-5-Ф в ходе функционирования ГМФ-пути, а АТФ - как продукт гликолиза.

17.2. СИНТЕЗ НИКОТИНАМИДДИНУКЛЕОТИДА

Микробиологический синтез никотинамиддинуклеотида (НАД) происходит путем культивирования Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 с предшественником. Выращивание продуцента рекомендуется проводить на средах, содержащих глюкозу, мочевину, дрожжевой экстракт, фосфаты, соли магния, кальция и биотин. Предшественниками НАД в среде могут быть никотиновая кислота и никотинамид. В условиях опыта предшественники обычно вводят на вторые сутки роста культуры (рис. 17.2). К пятым суткам в среде накапливается НАД, и культура вступает в фазу стационарного роста. Помимо НАД, в среде содержится промежуточный продукт его синтеза - мононуклеотид никотиновой кислоты. Никотиновая кислота включается непосредственно в синтез, и если в среду вводят ее амид, происходит ферментативное дезаминирование с образованием кислоты. Ниже дана схема синтеза НАД, где фосфорибозилпирофосфат обозначен буквами ФРФФ, а остатки фосфорной кислоты в нуклеотидах - Ф (рис. ). На этой же схеме показана также реакция, в результате которой образуется никотинамиддинуклеотидфосфат (НАДФ). Реакцию осуществляет НАД-киназа, передающая фосфорный остаток от АТФ на НАД. Для получения НАДФ предложена также система, использующая в качестве ферментного препарата экстракт из клеток Proteus mirabilis IFO 3849, а компонентами служат НАД, п-нитрофенилфосфат, никотинамид, сульфат цинка, ацетатный буфер (рН 4,0). Однако в данном случае, помимо НАДФ, происходит синтез НАД-дифосфата и некоторых НАД-аналогов.

17.3. СИНТЕЗ ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Инозиновая кислота - метаболический предшественник важнейших пуриновых нуклеотидов - адениловой и гуаниловой кислот. Поэтому накопление инозиновой кислоты может происходить, если продуцент имеет блок в ферментных системах, осуществляющих дальнейшие ее превращения.

Очевидно, что не следует лишать структуру столь необходимых и важных метаболитов (адениловой и гуаниловой кислот). Введение их в среду для восполнения дефицита возможно, но довольно дорого. Поэтому предпочитают вводить в сферу реакции нуклеозид - инозин. Для получения 5'-инозиновой кислоты (5'-ИМФ) необходимо иметь источник фермента, фосфорилирующего инозин в 5'-положении рибозного остатка. Источниками фосфорилирующего фермента - нуклеозиддифосфаттрансферазы - могут служить многие микроорганизмы, относящиеся к родам Flavobacterium, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas. Донорами фосфора в этой реакции могут быть нуклеотиды, а также неприродные соединения - п-нитрофенилфосфат (п-НФФ), бензилфосфат, фенилфосфат.