Молекулярная биология (стр. 2 )

2. От С-конца молекулы фермента β-лактамазы из B. licheniformis после того, как он синтезируется, отделяется несколько аминокислот. Последовательность на С-конце этого фермента можно установить путем сравнения его с ферментом мутанта, у которого происходит сдвиг рамки считывания в результате вставки или делеции одного нуклеотида. Аминокислотные последовательности очищенного фермента из клеток дикого

9

типа и из клеток мутанта со сдвигом рамки представлены ниже, начиная с 263-го остатка до С-конца:

дикий тип: асн – мет – асн – гли – лиз

мутант: асн – мет – иле – три – глн – иле – цис – вал – мет – лиз – асп

А. В чем заключалась мутация, приведшая к сдвигу рамки?

Б. Определите количество аминокислот в новосинтезированном ферменте из клеток дикого типа и, насколько возможно, реальную последовательность для этого фермента.

2.Лабораторная работа № 3

Определение кодирующей рамки считывания

полинуклеотида, секвенированного по методу Ф. Сенгера

Оборудование: радиоавтографы секвенирования ДНК по методу Ф. Сенгера, линейки, таблица генетического кода.

Код белкового синтеза

Первая буква кодона	Вторая буква кодона	Третья буква кодона
У	Ц	А	Г
У	фен фен лей лей	сер сер сер сер	тир тир	цис цис три	У Ц А Г
Ц	лей лей лей лей	про про про про	гис гис глн глн	арг арг арг арг	У Ц А Г
А	иле иле иле мет	тре тре тре тре	асн асн лиз лиз	сер сер арг арг	У Ц А Г
Г	вал вал вал вал	ала ала ала ала	асп асп глу глу	гли гли гли гли	У Ц А Г

10

Ход работы:

1. Определить последовательность синтезированной цепи ДНК по радиоавтографам (взять около 100 нуклеотидов). Обозначить 5`- и 3`-концы фрагмента ДНК.

2. Написать последовательность исходной цепи ДНК.

3. Написать последовательность мРНК, которая будет синтезироваться при транскрипции с исходной цепи ДНК. Обозначить 5`- и 3`-концы мРНК.

4. Перевести последовательность мРНК в аминокислотную последовательность белка, используя таблицу генетического кода. При этом считывание триплетов необходимо начать с первого нуклеотида (1-ая рамка считывания), затем выполнить то же задание со второго и затем с третьего нуклеотида (вторая и третья рамки считывания соответственно).

5. Сделать вывод о том, какая из этих рамок считывания будет кодирующей (если принять во внимание, что на радиоавтографах представлена последовательность ДНК из внутренней области гена, то кодирующей будет та рамка считывания, которая не будет содержать стоп-кодонов).

Домашнее задание: подготовиться к семинару по теме "Некоторые вопросы репликации. Теломеразы".

Занятие V

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме: "Некоторые вопросы репликации. Теломеразы".

1.Ферменты и белковые факторы репликации.

2.Этапы репликации.

3.Проблема недорепликации концевых районов хромосом.

4.Структура и функции теломер.

5.Механизм действия теломеразы.

6.Теломерная теория старения.

7.Теломераза и онкогенез.

11

Практическая часть

1.Решение задач

1.Нарисуйте схематически репликационную структуру с двумя вилками, смещающимися в противоположных направлениях. Пометьте концы всех цепей (5' или 3') и укажите лидирующую и отстающую цепи в каждой репликативной вилке.

2. Фрагмент ДНК, изображенный на рисунке, является двухцепочечным на концах и одноцепочечным в середине. Для верхней цепи указана полярность.

А. На каком конце фрагмента, 5' или 3', находится указанный па нижней цепи остаток фосфата (Р)?

Б. Каким способом, по вашему мнению, будет заполняться с помощью репаративных внутриклеточных процессов разрыв в цепи ДНК?

В. Сколько фрагментов будет содержаться в нижней цепи, если разрыв в ней заполняется (в условиях реакции в пробирке) при наличии в среде только дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы?

5` 3`

 

P OH

3. Условно летальные мутации чрезвычайно полезны для генетического и биохимического анализа такого сложного процесса, как репликация ДНК. Температурочувствительные (ts) мутации, являющиеся одной из форм условно летальных мутаций, позволяют организму расти при определенной температуре (например. 30 °С), но препятствуют росту при более высокой температуре (например. 42 °С).

У Е. соli выделено большое число температурочувствительных мутантов. Все они дефектны по репликации ДНК при

12

42 °С, но не при ЗО °С. Если температура среды повышается с 30 до 42 °С синтез ДНК прекращается у этих мутантов одним из двух характерных способов. У «быстро останавливающихся» мутантов синтез ДНК прекращается сразу же, а у «медленно останавливающихся» мутантов это происходит только спустя много минут.

А. Попробуйте предсказать, мутациями в каких из нижеперечисленных белков, если они температурочувствительные, будет обусловлен «быстро останавливающийся» фенотип, а в каких «медленно останавливающийся». В каждом случае объясните ваше предсказание.

1. ДНК-топоизомераза I.

2. Инициаторный белок репликации.

3. Белок, дестабилизирующий спираль.

4. ДНК-геликаза.

5. ДНК-праймаза.

6. ДНК-лигаза.

Б. Характер репликации в бесклеточных экстрактах мутантов по существу не отличается от такового в интактных клетках. В экстрактах «быстро останавливающихся» мутантов при температуре 42 °С синтез ДНК прекращается сразу же, тогда как в случае «медленно останавливающихся» мутантов синтез ДНК продолжается в течение еще нескольких минут после повышения температуры до 42 °С. Предположим, что экстракты из мутанта, дефектного по температурочувствительной ДНК-геликазе, и из мутанта по температурочувствительной ДНК-лигазе были смешаны при 42°С. Какой фенотип будет показывать смесь: «быстро останавливающийся», «медленно останавливающийся» или немутантный?

2. Лабораторная работа № 4

Методы количественного определения нуклеиновых кислот

Для количественного определения нуклеиновых необходимо определить содержание хотя бы одного из трех ее основных компонентов: азотистых оснований, пентоз и фосфатов.

13

В соответствии с этим существуют три группы методов определения количества нуклеиновых кислот:

1. Определение содержания азотистых оснований путем измерения поглощения УФ-света;

2. Определение содержания пентоз с помощью цветных реакций;

3. Определение фосфора.

Спектрофотометрические методы определения ДНК и РНК

В основе метода лежит характерное свойство азотистых оснований, являющихся производными гетероциклических соединений – пурина или пиримидина, интенсивно поглощать УФ-свет. Спектрофотометрические методы ввиду их быстроты и точности, а также высокой чувствительности (на спектрофотометре СФ-4, например, можно определить до 5 мкг нуклеиновых кислот), применяются в настоящее время очень широко.

Максимум спектра поглощения света нуклеиновыми кислотами находится обычно вблизи 260 нм. Для определения содержания в растворе чистых препаратов нуклеиновых кислот достаточно одного измерения поглощения при 260 нм. Одна единица экстинкции при этой длине волны соответствует примерно 40 мкг чистой РНК или 47 мкг чистой ДНК.

Однако наличие ненуклеиновых примесей в исследуемых препаратах часто делает определение ненадежным. Для устранения влияния таких примесей проводят измерение УФ-поглощения гидролизатов нуклеиновых кислот при двух длинах волн и пользуются разностью экстинкций. Первую длину волны выбирают с таким расчетом, чтобы она находилась вблизи максимума поглощения, и нуклеиновые кислоты с разным нуклеотидным составом обладали при ней более или менее одинаковым поглощением. Вторую длину волны подбирают, по возможности, чтобы поглощение примесей (ароматических аминокислот, полипептидов) при ней было равно поглощению примесей в первой точке. При этих условиях измерения дают наиболее точные результаты.

14

Чаще всего используют спектрофотометрический метод определения содержания РНК и ДНК в их гидролизатах, разработанный (1956 г.).

Работа 3.1. Количественное определение содержания ДНК

спектрофотометрическим методом (по )

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл водного раствора ДНК и 2 мл 1 N раствора хлорной кислоты (HСlO4). Пробу помещают в кипящую водяную баню на 30 минут. Затем пробу охлаждают и определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против контрольного раствора 0,5 N хлорной кислоты.

Рассчитывают содержание ДНК в 1 мл исследуемого раствора по формуле:

Колориметрические методы определения

содержания нуклеиновых кислот