Молекулярная биология (стр. 4 )

21

Занятие VII

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме "Транскрипция".

Этапы транскрипции. РНК-полимеразы. Регуляция транскрипции у прокариот. lac-оперон – пример негативной регуляции. Уровни контроля генной экспрессии у эукариот. Регуляция транскрипции у эукариот. Цис-регуляторные элементы. Транскрипционные факторы. Роль структуры хроматина в транскрипции.

Практическая часть

Лабораторная работа № 5

Индукция гена β-галактозидазы

Фермент β-галактозидаза расщепляет лактозу на галактозу и глюкозу. lac-оперон подвержен негативной регуляции. В отсутствии субстрата лактозы lac-оперон репрессирован и β-галактозидаза представлена только в виде немногих молекул на клетку. Когда в питательной среде появляется лактоза, lac-оперон индуцируется. Молекула индуктора связывается со специфическим сайтом на репрессоре, вызывая конформационные изменения в репрессоре, что приводит к его диссоциации от оператора. Индуктором может быть не только лактоза, но и изомер лактозы, называемый аллолактозой. Аллолактоза (или изопроилтио-β-галактозид, ИПТГ) связывается с lac-репрессором (белок-репрессор). После диссоциации репрессора гены lac-оперона экспрессируются и концентрация β-галактозидазы увеличивается в 1000 раз. Изопропилтио-β-галактозид является неметаболизируемым индуктором, т. е. он не используется в качестве субстрата. В качестве субстрата используют хромогенное соединение 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-Д-галактозид, X-Gal или 5-бром-3-индолил-β-Д-галактозид, Y-Gal.

22

lac-оперон используют для индикации трансформации и рекомбинации на основе явления L-комплементации. Феномен L-комплиментации заключается в том, что NH2-концевой фрагмент β-галактозидазы размером 146 аминокислот способен комплиментировать определенную мутантную β-галактозидазу бактериальной клетки. Если такой фрагмент вносят в мутантную клетку, то в этой клетке образуется активная β-галактозидаза и в присутствии индуктора ИПТГ и хромогенного субстрата Х gal (Y gal) колонии приобретают голубую окраску. В ген lac 2 помещают полилинкер для клонирования чужеродной ДНК, который не нарушает L-комплиментацию. Но если в область полилинкера встраивают вставку с чужеродной ДНК, то L-комплиментация нарушается, и клетки, получившие рекомбинантную ДНК, образуют неокрашенные колонии.

Оборудование: чашки Петри, бактериологическая петля или шпатели, деревянные зубочистки или спички с заостренным концом (стерильные).

Реактивы:

-изопропилтио-β-галактозид (ИПТГ) (водный раствор 200 мг/мл (10 мМ), его можно заморозить и хранить при –200С);

-5-бром-3-индолил-β-галактозид (Y-Gal);

-диметилформамид 20 мг/мл;

-среда для выращивания бактерий LBA (на 1 л бидистиллированной воды: 10 г бактопептона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl (pH 7,5 (NaOH)), агар 1,2 – 1,5 % (12 – 15 г). Среду стерилизуют, автоклавируя по 0,5 л в колбе на 1 л. Затем горячий агар разливают по чашкам Петри (1л агаровой среды помещается в 25 – 30 чашек). Агар в чашках подсушивают в течение 1 – 3 суток, после чего они готовы к работе, т. к. не "отпотевают".

Материалы:

В работе используются следующие штаммы бактерий:

1. Agrobacterium tumefaciens – без β-галактозидазы;

5.  E. coli XL1-Blue с рекомбинантной плазмидой pBluescript с нарушенной α-комплиментацией;

6.  E. coli К802 c pRT104, несущей активную β-галактозидазу.

Культуры выращивают в течение ночи, A. tumefaсiens при 250С, E. coli при 370С. Затем их можно хранить при + 40С 10-15 дней.

23

Изопропилтио-β-галактозид (ИПТГ):

CH2OH CH O | HO S – C – H Н | HO H CH H H H OH

5 бром-3-индолил-β-галактозид (Y-Gal):

Вг NH CH2 – CH – O – Gal

Ход работы.

На чашку Петри с высушенным агаром наносят 100 мл раствора Y-Gal и тщательно распределяют по поверхности среды. Затем вносят 5 мкл ИПТГ и снова распределяют.

Стерильной зубочисткой касаются колонии бактерий и наносят легкие штрихи на поверхность агара (используются три культуры). Затем чашки инкубируют в течение ночи при соответствующей температуре.

Ожидаемый результат:

1. A. tumefaсiens – бесцветные колонии.

2. E. coli XL1 Blue – бесцветные или слабоголубые колонии.

3. E. coli К802 (pRT104) – ярко-синие колонии.

24

Домашнее задание: подготовиться к семинару по теме "Строение белков. Глобины".

Занятие VIII

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме "Строение белков. Глобины".

1.Строение белков. Уровни организации белков.

2.Глобины. Гемоглобин.

Практическая часть

1. Лабораторная работа № 6

Обнаружение геминовой кислоты группы гемоглобина

крови посредством бензидиновой и гваяковой проб

Реакция обусловлена способностью гемоглобина катализировать окисление бензидина и гваяковой смолы пероксидом водорода. В обычных условиях эта реакция идет очень медленно, но в присутствии катализаторов – моментально. Гем, обладающий каталитической активностью в этой реакции, резко ускоряет окисление бензидина в парахинондиимин. Аналогично протекает реакция и с гваяковой смолой. Реакция очень чувствительна и под названием бензидиновой или гваяковой пробы на кровь применяется в судебно-медицинской экспертизе.

Оборудование, реактивы: пробирки; пероксид водорода (3%-ный); свежеприготовленные бензидин (5%-ный) в ледяной уксусной кислоте; гваяковая смола (2%-ная) в этаноле (95%-ном); кровь.

Ход работы: в две пробирки наливают по 1 мл цельной крови, разведенной в 5000 раз, кипятят несколько минут на водяной бане и охлаждают. Затем к одной из них приливают 5 капель раствора бензидина, а к другой – гваяковой настойки.

25

Перемешивают и в каждую из пробирок добавляют по несколько капель 3%-ного раствора пероксида водорода. В обоих случаях развивается окраска от зеленого до синего тона.

2.Лабораторная работа № 7

Получение кристаллов гемина из гемоглобина

Ход работы. Каплю свежей крови, взятой из пальца, поместить на предметное стекло и дать ей высохнуть на воздухе. К подсушенной крови прибавить 2-3 капли ледяной уксусной кислоты и стеклянной палочной тщательно перемешать сухую кровь с уксусной кислотой. Смесь накрыть покровным стеклом и осторожно нагреть до появления пузырьков, т. е. до начала кипения. Предметное стекло следует держать высоко над пламенем горелки, чтобы избежать быстрого выкипания жидкости. После охлаждения препарат рассмотреть под микроскопом. Кристаллы гемина, образовавшиеся при разрушении гемоглобина, имеют вид мельчайших ромбоидальных пластинок, окрашенных в бурый цвет, иногда сложенных в виде звездочек, чаще разбросанных в виде палочек. Если обнаружить кристаллы не удается, то следует приподнять покровное стекло, прибавить 2-3 капли уксусной кислоты, продолжить нагревание и по охлаждении исследовать под микроскопом. Форму кристаллов зарисовать.

Домашнее задание: подготовиться к семинару по темам "Фолдинг белков", "Транспорт белков", "Деградация белков".

Занятие IX

Теоретическая часть

Семинарское занятие по темам "Фолдинг белков", "Транспорт белков", "Деградация белков".

1.Нативная структура белка. Ко - и посттрансляционный фолдинг.

2.Формирование нативной пространственной организации белка.

26

3.Регуляция фолдинга белков.

4.Молекулярные шапероны.

5.Сортировка белков в клетке. Сигнальные последовательности.

6.Механизмы транспорта белков через мембраны.

7.Импорт белков в органеллы.

8.Процессинг белка в органеллах.

9.Роль катаболизма в обновлении белков в клетке.

10.Стадии деградации белков.

11.Убиквитин-протеосомная система протеолиза белков.

Практическая часть

1. Решение задач

1.Шероховатый эндоплазматический ретикулум (ЭР) - это место синтеза различных мембранных белков. Некоторые из них остаются в ЭР, другие распределяются по различным компартментам, например, в аппарат Гольджи, лизосомы, плазматическую мембрану. Сложность проблемы сортировки зависит от того, какая степень "очистки" должна быть достигнута при переносе из ЭР в другие компартменты. Например, если мембранные белки, предназначенные для плазматической мембраны, составляют 90% всех имеющихся в ЭР белков, то требуется лишь небольшая степень очистки (и проблема сортировки данного белка представляется сравнительно легкой). С другой стороны, если белки плазматической мембраны составляют только 0,01% всех белков в ЭР, то понадобится значительная очистка (и проблема сортировки становится гораздо более трудной).

Каковы масштабы процессов сортировки? Какая доля мембранных белков, находящихся в ЭР, предназначается для других компартментов? Несколько простых допущений позволяют количественно оценить эти процессы. Предположим, что все белки на пути следования в другие компартменты остаются в ЭР в среднем в течение 30 мин до того, как выйдут из него, и что соотношение белков и липидов в мембранах всех клеточных органелл одинаково.

27

А. В типичной растущей клетке, которая делится каждые 24 ч, через ЭР должны каждые сутки проходить все белки, необходимые для сборки новой плазматической мембраны. Если мембрана ЭР по площади в 20 раз больше плазматической мембраны, то каково соотношение между белками плазматической мембраны и другими мембранными белками в ЭР?

Б. Если в одной и той же клетке площадь мембран аппарата Гольджи втрое больше площади плазматической мембраны, то каково соотношение между белками мембран Гольджи и другими мембранными белками в ЭР?