Молекулярная биология (стр. 1 )

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биолого-почвенный факультет

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Методические указания

для выполнения лабораторных работ

Иркутск, 2006

Печатается по решению научно-методического совета

Иркутского государственного университета

Методические указания по молекулярной биологии предназначены для студентов-биологов 3 курса и включают лабораторные работы и задачи к общепрофессиональной дисциплине "Молекулярная биология".

Составители:

к. б.н., доцент кафедры физиологии растений и клеточной биологии

к. б.н., доцент кафедры физиологии растений и клеточной биологии

ассистент кафедры

ассистент кафедры

Занятие I

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме "Строение нуклеиновых кислот"

1.  Первичная структура нуклеиновых кислот.

2.  Макромолекулярная структура нуклеиновых кислот.

Практическая часть

1.  Решение задач

1. Напишите нуклеотидную последовательность второй цепи ДНК, если первая имеет последовательность (5`) ATGGTATGCATTC (3`), в стандартной записи (в направлении 5` → 3`).

2. Одна из цепей двухспиральной ДНК имеет следующий нуклеотидный состав (относительное молекулярное содержание): [A] = 0,30, [G] = 0,24.

а) Что можно сказать о содержании [T] и [C] в той же цепи?

б) Что можно сказать о содержании [A], [G], [T] и [C] в комплементарной цепи?

3. В препаратах ДНК, выделенных из двух неидентифицированных видов бактерий, содержание аденина составляет соответственно 32 и 17% общего содержания оснований. Какие относительные количества аденина, гуанина, тимина и цитозина Вы предполагаете найти в этих двух препаратах ДНК? Какие Вы сделали допущения? Одна из бактерий была выделена из горячего источника (64оС). Какая из ДНК принадлежит термофильной бактерии? На чем основывается Ваш ответ?

3

4. ДНК бактериофага М13 имеет следующий нуклеотидный состав: А – 23%, Т – 36%, G – 21%, С – 20%. Что говорят Вам эти цифры о ДНК данного фага?

2. Лабораторная работа № 1

Гидролиз нуклеопротеидов и проведение качественных реакций

на составные компоненты

Цель работы: определить вещества, образовавшиеся при гидролизе нуклеопротеидов.

1.1. Обнаружение белков с помощью биуретовой реакции.

Ход работы: В пробирку налить 10 капель гидролизата, 10 капель 10% раствора NaOH и 2 капли 1% раствора сернокислой меди. Появляется красно-фиолетовое (или сине-фиолетовое) окрашивание.

1.2. Обнаружение углеводов (пентоз) реакций Фелинга.

Ход работы: В пробирку налить 10 капель гидролизата. Нейтрализовать раствор 10% едким натром до щелочной среды (по лакмусовой бумажке) и добавить равный объем раствора Фелинга. Содержимое пробирки нагреть до кипения. В присутствии углеводов выпадает красный осадок закиси меди.

1.3. Обнаружение фосфорной кислоты.

Ход работы: В пробирку налить 10 капель гидролизата, добавить 2 капли амидола и 10 капель молибденовокислого аммония. Смесь слегка нагреть. Фосфорная кислота с молибденовокислым аммонием образует синий осадок – фосфомолибденовый аммоний.

4

1.4. Обнаружение пуриновых оснований.

Ход работы: В пробирку налить 10 капель гидролизата, добавить 5 капель 15% аммиака и 2 – 3 капли 1% азотнокислого серебра. В присутствии пуриновых оснований через 5 – 7 минут выпадает желатинообразный желто-бурый осадок солей серебра.

Домашнее задание: Подготовиться к семинару по теме "Полимеразная цепная реакция".

Занятие II

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме "Полимеразная цепная реакция".

1. Цикл реакции амплификации ДНК.

2. Компоненты ПЦР.

3. Применение ПЦР

Практическая часть

Лабораторная работа № 2

Выделение дезоксирибонуклеопротеидов из молок горбуши

Дезоксирибонуклеопротеиды (ДРНП) выделяют из тканей, богатых клеточными ядрами (зобная железа, селезенка, сперматозоиды и проч.). ДРНП растворяются в растворах солей средней концентрации, например, в хлориде натрия (1М), с образованием вязких растворов и снова осаждаются при разведении последних (до 0,15 М) в виде волокнистого нуклеопротеида.

5

Дезоксирибонуклеиновую кислоту обнаруживают по методу Дише – ее реакции с дифениламином, который с дезоксирибозой дает синее окрашивание. Рибонуклеиновая кислота (или рибоза), в отличие от ДНК, дает с этим реактивом зеленое окрашивание.

Оборудование: ступки, пестики, песок, деревянные палочки, весы с разновесом, цилиндры на 25 мл, стаканы на 200 мл, пипетки на 1, 2, 5 мл, воронки, фильтры из марли, колбочки на 50 мл для фильтрования, водяная баня, плитка, пробирки.

Реактивы: молоки, 1 М NaCl, 2 М NaCl, 0,4 % NaOH, спирт 96%, дифениламин (1 т дифениламина в 2,75 мл концентрированной серной кислоты и 100 мл ледяной уксусной кислоты).

Ход работы: 5 г молок растирают в ступке с равным количеством песка, добавляют 5 мл охлажденного 2 М раствора NaCl, продолжают растирание, а затем малыми порциями постепенно добавляют 25 мл охлажденного 1 М NaCl. Растирают 10 – 15 минут. Полученный гомогенат фильтруют через 4 слоя марли в колбу. Фильтрат осторожно вливают в 20 – 30 мл спирта, медленно перемешивают деревянной палочкой. Выделившиеся в виде нитей нуклеопротеиды наматывают на палочку.

В пробирку переносят осадок ДНК с помощью палочки и растворяют его в 1 – 2 мл 0,4 % растворе NaОН. Прибавляют равный объем раствора дифениламина и смесь нагревают на кипящей водяной бане 10 – 15 минут. Появляется синее окрашивание раствора.

Домашнее задание: подготовиться к семинару по теме "Секвенирование нуклеиновых кислот".

Занятие III

Теоретическая часть

Семинарское занятие по теме "Секвенирование нуклеиновых кислот".

6

Метод секвенирования А. Максама – У. Гилберта. Секвенирование по Ф. Сенгеру. Определение первичной структуры РНК.

Практическая часть

Решение задач

1. Если пробирки, содержащие препараты ДНК, выделенные из E. coli и из морского ежа, будут случайно перепутаны, то как Вы определите, где какой препарат?

2. Образец двухцепочечной линейной ДНК, тщательно выделенной из одного вида ракообразных, нанесен на сетку при 200С и проанализирован с помощью электронного микроскопа. Другой образец той же ДНК предварительно выдержан при 600С в течение 30 минут, а затем также проанализирован с помощью электронной микроскопии. Вот так схематически выглядят эти образцы:

200С 600С

 

Как Вы объясните такой результат? Какую полезную информацию можно извлечь из наблюдаемого явления?

3. В печени крысы имеется фермент, в полипептидную цепь которого входит 192 аминокислотных остатка. Этот фермент кодируется геном, включающим 1440 пар оснований. Объясните взаимосвязь между числом аминокислотных остатков в ферменте и числом пар оснований в соответствующем ему гене.

4. Почему при секвенировании ДНК химическим методом молекула ДНК должна быть мечена только по одному концу, а не равномерно?

7

5. На рисунке приведена схема радиоавтографа геля с четырьмя дорожками фрагментов ДНК, образовавшихся при химическом расщеплении. ДНК содержала метку Р32 на 5`-конце. Какова последовательность этой ДНК?

Расщепление по

A G C T

Домашнее задание: подготовиться к семинару по темам "Геном митохондрий и хлоропластов", "Биоинформатика", "Геномика".

Занятие IV

Теоретическая часть

Семинарское занятие по темам "Геном митохондрий и хлоропластов", "Биоинформатика", "Геномика".

1.Геном митохондрий.

2.Геном хлоропластов.

3.Биоинформатика, или применение компьютерных методов для решения задач молекулярной биологии.

4.Геномика. Проект "Геном человека".

8

Практическая часть

1.Решение задач

1. Одна цепь участка ДНК, выделенной из Е. coli, имеет следующую последовательность оснований: 5' GTAGCCTACCCATAGG 3'.

А. Допустим, что с этой ДНК транскрибируется мРНК, причем матрицей служит комплементарная цепь. Какова будет последовательность мРНК?

Б. Какой пептид будет синтезироваться, если трансляция начинается точно с 5'-конца этой мРНК (предположите, что не требуется никакого стартового кодона, как это и происходит при определенных условиях опытов в пробирке)? Когда от рибосомы отделяются тРНКAla, какая тРНК связывается следующей? Когда аминогруппа аланина образует пептидную связь, какие связи разрываются, и разрываются ли вообще, и что происходит с тРНКAla?

В. Сколько пептидов кодирует эта мРНК? Будут ли синтезироваться такие же пептиды, если матрицей для трансляции будет служить другая цепь ДНК?

Г. Предположите, что эта последовательность ДНК транскрибируется, как указано в пункте А, но вам неизвестно, какая рамка считывания используется. Может ли этот участок ДНК относиться к началу гена, к его середине, к его концу?