Молекулярная биология (стр. 6 )

Готовят три серии стандартных растворов, содержащих от 1 до 10 мг белка в 1 мл раствора. Вместо кристаллического белка для этого может быть взята сыворотка крови или гемолимфа, в которой предварительно определено содержание белка рефрактометрическим методом. Разведение до необходимых концентраций белка при приготовлении серии растворов осуществляют 1%-ным раствором хлорида натрия.

Готовят биуретовый реактив, растворяя последовательно в мерной колбе на 250 мл 0,375 г CuSO4 • 5H2O и 1,5 г сегнетовой соли (КООС—СНОН—СНОН—СООNа • 4H2O) в 150 мл воды. Приливают медленно при постоянном перемешивании

34

75 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и доводят содержимое до 250 мл водой. Биуретовый реактив не подлежит длительному хранению в стеклянной посуде.

Берут из первой серии по 1 мл каждого стандартного раствора белка в отдельные пробирки и приливают в каждую из них по 8 мл биуретового реактива. Оставляют на 30 мин при комнатной температуре и фотометрируют в кюветах (длина 1 см) при 540 нм против контроля (вместо раствора белка берут 1 мл дистиллированной воды). Определение повторяют 3 раза, беря каждый раз новую серию стандартных растворов белка. По полученным значениям экстинкций строят калибровочную кривую.

1 мл сыворотки или 1 мл гемолимфы разводят 1%-ным раствором хлорида натрия в 10 раз. К 1 мл разведенного раствора, взятому в пробирку, приливают 8 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют на 30 мин. Фотометрируют против контроля при 540 нм в кювете (длина 1 см). По калибровочному графику определяют содержание белка в пробе и выражают его далее с учетом разведения в процентах в целом препарате.

Количественное определение белка по методу Лоури

Оборудование, реактивы. Фотоэлектроколориметр; цилиндры мерные с носиком на 50 и 10 мл; пипетки градуированные на 1,5 и 10 мл; набор пробирок стеклянных химических; раствор А: карбонат натрия (2%-ный) в гидроксиде натрия (0,1 н.); раствор В: медный купорос (0,5%-ный) в цитрате натрия (1%-ном) или в тартрате калия или натрия (3,33%-ноы); раствор С: реактив Фолина; препарат белка.

Среди методов, основанных на количественном определении белков посредством цветных реакций, наиболее распространен и обладает высокой чувствительностью метод Лоури. Как и все другие основанные на цветных реакциях методы, он дает абсолютные данные о содержании белков только в том случае, если калибровочный график (см. ниже) построен по тому же самому белку, определение которого ведут при посредстве цветной реакции.

35

Метод Лоури основан на измерении интенсивности окраски раствора, в котором осуществляется цветная реакция на белок (реакция Фолина) с тирозиновым и цистеиновым радикалами белковой молекулы, состоящая в восстановлении смеси фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот (реактив Фолина) с образованием комплексного соединения синего цвета. Указанной реакции восстановления способствуют комплексные соединения меди, возникшие при взаимодействии белка со щелочным раствором медного купороса. Хотя реакция Фолина не очень специфична, но зато весьма чувствительна. Поэтому метод Лоури позволяет вести определения белков в сильно разбавленных растворах, где количество их выражается всего лишь десятками микрограммов и, как правило, применяется для учета белков в элюатах с колонок при фракционировании на ионообменных смолах и сефадексах.

Перед проведением определения смешивают 49 мл раствора А с 1 мл раствора В. К 1 мл исследуемого белкового раствора, содержащего от 10 до 100 мкг белка, добавляют 4 мл смеси растворов А и В. Встряхивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем быстро приливают из пипетки 0,4 мл реактива Фолина, энергично перемешивают и оставляют на 30 – 90 мин для развития окраски. При этом желтая окраска раствора постепенно переходит в синюю. Оптическую плотность раствора измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 750 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см.

Содержание белка в испытуемой пробе устанавливают по калибровочной кривой, построенной заранее по раствору какого-либо чистого белка точно известной концентрации. Лучше всего использовать раствор того белка или смеси белков, определение которых ведут по методу Лоури. По полученным данным строят график – калибровочную кривую:

Если теперь соединить горизонтальной линией какое-то значение экстинкции на шкале ординат (на ней отложены значения оптической плотности) с калибровочной кривой и из точки пересечения опустить на ось абсцисс (на ней отложена концен

36

Калибровочная кривая для определения белка по методу Лоури. В качестве эталона использован кристаллический сывороточный альбумин быка.

трация белка в микрограммах в пробе) перпендикуляр, то точка пересечения последнего с осью абсцисс укажет содержание белка в микрограммах в пробе. Вслед за этим делают пересчет содержания белка на 100 мл исследуемого раствора или другую размерность.

Количественное определение белка по методу Бредфорд

Оборудование, реактивы. Спектрофотометр СФ-4а или СФ-16; набор проби-ргк стеклянных химических; пипетки: на 0,1 мл (2 шт.), 5 мл и 50 мл; мерные 1.. лбы: на 1 л и на 0,1 л (5 шт.), кумасси бриллиантовый голубой((3-250); этанол (95%-ный); фосфорная кислота (85%-ная).

Приготовление реактива Бредфорд. 100 мг кумасси бриллиантового голубого (Q = 250) растворяют в 50 мл 95%-ного этанола и добавляют 100 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты. Полученный раствор доводят до 1 л бидистиллированной водой. Реактив Бредфорд пригоден в течение 10 дней при хранении в темноте.

37

Построение калибровочной кривой. 160 мл бычьего сывороточного альбумина отвешивают на аналитических весах и растворяют в бидистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл. Концентрация полученного исходного раствора белка —1600 мкг/мл. Путем разбавления исходного раствора, каждый раз вдвое (50 мл предыдущего раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят бидистиллированной водой до метки) получают серию растворов белка с концентрациями от 100 до 1600 мкг/мл (всего 5 растворов, включая исходный). С полученными растворами бычьего сывороточного альбумина осуществляют процедуру, приведенную ниже. Все операции повторяют трижды, используя каждый раз новые серии растворов бычьего сывороточного альбумина, приготовленные независимо друг от друга.

Калибровочную кривую строят, откладывая значения экстинкций при 595 нм по оси ординат, а количество белка в пробе – по оси абсцисс.

Ход определения. 0,1 мл исследуемого раствора, содержащего от 100 до 1600 мкг белка в объеме 1 мл, микропипеткой вносят в пробирку и добавляют 5 мл реактива Бредфорд. По перемешивании раствор спектрофотометрируют при 595 нм (не ранее, чем через 2 мин, и не позже 1 ч) против контроля, содержащего 0,1 мл буфера, на котором приготовлен исследуемый раствор белка и 5 мл реактива.

Количество белка в пробе определяют по калибровочной кривой:

Калибровочная кривая для определения белка по методу Бредфорд.

38