В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин - синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин - синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Пятый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы X-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3’-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин - синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Шестой аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3’-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин - синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Седьмой аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, включающий стадии:
- обеспечение первого экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 и терминатор транскрипции;
- обеспечение второго экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2 и терминатор транскрипции;
-получение штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором;
- совместное введение штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором, в клетки растения рода Nicotiana;
- культивирование полученного растения и сбор листьев;
- выделение и очистка антител из собранных листьев.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно первому аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе X-вируса картофеля согласно второму аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно шестому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно третьему аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе X-вируса картофеля согласно пятому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительных вариантах воплощения растение выбирают из Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana excelsior.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения растение представляет собой Nicotiana benthamiana.
В предпочтительных вариантах воплощения растения культивируют в почве в условиях теплицы или климатической камеры со световым режимом: день 16 часов, ночь 8 часов.
Восьмой аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, полученное заявленным способом.
Девятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в качестве терапевтического агента для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 |
