Способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, полученное этим способом, и его применение (стр. 3 )

В предпочтительных вариантах воплощения применение дополнительно включает введение второго терапевтического агента, ингибирующего активность HER2/neu.

В более предпочтительных вариантах воплощения вторым терапевтическим агентом является ингибитор тирозинкиназы.

В наиболее предпочтительном варианте воплощения ингибитор тирозинкиназы представляет собой лапатиниб.

В более предпочтительных вариантах воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело, взаимодействующее с экзоклеточной частью онкобелка HER2/neu.

В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело трастузумаб.

В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело фитотрастузумаб.

Десятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, при изготовлении лекарственного средства для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.

Перечень фигур

На Фиг. 1 представлена схему строения бинарного вектора рА16571, кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где RB и LB – соответственно, правая и левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; 35S – транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК); PolyA/T – полиаденилирующий сигнал ВМЦК/терминатор транскрипции геномной РНК ВМЦК. S1-лидер – 5’-нетранслируемая область геномной РНК ВМЦК.

На Фиг. 2 представлена схему строения бинарного вектора рА16671, кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu. Условные обозначения те же, что и на Фиг. 1.

На Фиг. 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие b-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси. Показано накопление собранных полноразмерных антител в листьях N. benthamiana после совместной инфильтрации вектором, содержащем ген легкой цепи, и вектором, содержащем ген тяжелой цепи. Использованы последовательности, кодирующие разные сигнальные пептиды (указаны названия конструкций), дорожки:

1. pA-L-cyt + pA-H-cyt

2. pA-L-pec + pA-H-pec

3. pA-L-cal + pA-H-cal

4. pA-L-iaa + pA-H-iaa

5. pA-L-ea2 + pA-H-ea2

6. pA-L-aa + pA-H-aa

7. pA-L-abp + pA-H-abp

8,9. рА16571 + рА16671

Инфильтрированные листья были собраны 5, 7 или 9 день (dpi). Дорожка U, неинфицированный лист; дорожка S, 1 µg hIgG; дорожка M, маркеры мол. веса. Область полноразмерных антител выделена стрелкой.

На Фиг. 4 представлена схема строения бинарного вектора рА16921, основанного на кДНК ХВК и кодирующего легкую (L) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB – левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Т – нопалинсинтазный терминатор; NPT – ген неомицинфосфотрансферазы; Р – нопалинсинтазный транскрипционный промотор; 35S – транскрипционный промотор ВМЦК; ген репликазы ХВК, L-цепь – легкая цепь; НТО – 3’нетранслируемая область геномной РНК ХВК; Т – 35S терминатор ВМЦК; RB – правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.

На Фиг. 5 представлена схема строения бинарного вектора рА16722, основанного на кДНК крВТМ и кодирующего тяжелую (Н) цепь антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, где (слева направо) LB – левая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора; Т – нопалинсинтазный терминатор; NPT – ген неомицинфосфотрансферазы; Р – нопалинсинтазный транскрипционный промотор; Act2 – актиновый транскрипционный промотор 2 из арабидопсиса; ген репликазы крВТМ; ТБ – транспортный белок крВТМ, Н-цепь – тяжелая цепь; НТО – 3’нетранслируемая область геномной РНК крВТМ; Т – нопалинсинтазный терминатор; RB – правая часть участка встраивания в геном растения бинарного вектора. Стрелки показывают направление транскрипции.

На Фиг. 6 приведены результаты анализа тотального растворимого белка листьев N. benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 7,5% ПААГ в невосстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: 1- интактный лист (отрицательный контроль); 2, 4, 6 – листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую (рА11903) цепь антитела трастузумаб; 3, 5, 7 – листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671 (зона, соответствующая полноразмерному антителу, отмечена *); +К – 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); MR – маркеры молекулярного веса.

На Фиг. 7 приведены результаты анализа фракций очищенного на колонке с протеин-A сефарозой моноклонального антитела, выделенного из листьев N. benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ в восстанавливающих условиях с последующей окраской Кумасси. Дорожки: MR – маркеры молекулярного веса; +К – 3 мкг трастузумаба (положительный контроль); 1 – 2 мкг из фракции №3; 2 – 2 мкг из фракции №4. Отмечены зоны, соответствующие тяжелой (H) и легкой (L) цепи антитела.

На Фиг. 8 приведены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов из листьев N. benthamiana, агроинъецированных бинарными векторами рА16571 и рА16671. Разделение в 12% ПААГ. Дорожки: 1 – интактный лист (отрицательный контроль); 2 - листья, инъецированные бинарными векторами, кодирующими легкую (рА11866) и тяжелую цепь (рА11903) антитела трастузумаб под контролем 35S-промотора; 3 - листья, инъецированные бинарными векторами рА16571 и рА16671; +К – 120 нг трастузумаба в случае L цепи, 60 нг трастузумаба в случае Н цепи (положительный контроль). Зоны, соответствующие легкой и тяжелой цепи, отмечены * Слева: вестерн-блот с антителами против легкой каппа-цепи иммуноглобулина G человека. Справа: вестерн-блот с антителами против тяжелой гамма-цепи иммуноглобулина G человека.

На Фиг. 9 приведены результаты анализа аффинности рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SKBR-3 по данным проточной цитометрии. Клетки инкубировались с антителами в указанных по оси абсцисс концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл. По оси ординат – процент связавшихся с антителами клеток.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение представляет собой способ продукции в клетках растения функционально активного моноклонального антитела против домена димеризации HER2/neu. Гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи МА против домена димеризации онкогена Her2/neu, могут быть экспрессированы в клетке растения с получением полностью функционального антитела, специфически связывающегося с Her2/neu как in vitro, так и in vivo.

Описанный в изобретении способ предполагает создание экспрессионных векторов, направляющих в клетке растения синтез тяжелой (Н) и легкой (L) цепи антитела, введение указанных векторов в клетки растения с последующим культивированием в условиях, обеспечивающих совместную экспрессию в растительной клетке генов тяжелой и легкой цепи МА с последующей сборкой полноразмерного МА.

Для продукции МА в растительной клетке могут быть созданы как неамплифицирующиеся (см. Пример 2) экспрессионные векторы, так и амплифицирующиеся, на основе геномов вирусов растений (см. Пример 4). Экспрессионные векторы содержат транскрипционную кассету (промотор и терминатор транскрипции), узнаваемую ДНК-зависимой РНК полимеразой растительной клетки. В качестве промотора и терминатора могут быть использованы как последовательности из генома растений, так и из генома бактерий (например, агробактерий) или вирусов (например, ВМЦК) растений (см. Фиг. 1, 2 Примера 2, Фиг. 4, 5 Примера 4). При создании экспрессионных амплифицирующихся векторов – векторов на основе геномов вирусов растений – необходимо учитывать тот факт, что продукция легкой и тяжелой цепи МА в одной и той же клетке возможна при условии отсутствия конкуренции между вирусами, геномы которых использованы. Наши эксперименты показывают, что ВТМ и ХВК не только не конкурируют между собой, но ХВК даже стимулирует репродукцию ВТМ. Анализ механизмов репродукции синдбис-подобных фитовирусов показывает, что конкуренция между ними происходит на стадии формирования так называемых вирусных «фабрик», когда вирусная репликаза локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума. ВТМ и ХВК не конкурируют между собой на стадии формирования репликативного комплекса и вирусной «фабрики». Вирус желтой мозаики турнепса (ВЖМТ), формирующий вирусную «фабрику» на мембранах хлоропластов, также не конкурирует с ВТМ и ХВК и поэтому может быть использован в комбинации с ВТМ или ХВК для синтеза антитела.

Согласно изобретению, нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепи МА, могут быть получены на основе аминокислотной последовательности с помощью инструмента «обратной трансляции» параллельно с проведением оптимизации кодонового состава с учетом частоты встречаемости тех или иных кодонов в тех растениях, которые в дальнейшем будут использованы для продукции МА.

Для осуществления эффективного процессинга и сборки МА аминокислотная последовательность каждой из цепей антитела должна содержать сигнальный пептид, направляющий белки через эндоплазматический ретикулум в апопласт. В отсутствие сигнальных пептидов МА в растительной клетке собираться не будет. Можно использовать как одинаковые, так и разные сигнальные пептиды для легкой и тяжелой цепи с целью определения наиболее оптимального сочетания (см. Пример 3).

В контексте настоящего изобретения экспрессионные векторы, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела против домена димеризации онкогена Her2/neu, могут быть созданы на основе бинарного вектора pCambia1300 или pBIN19 (см. Пример 2 и 4). Эти плазмиды обеспечивают возможность использования Agrobacterium tumefaciens для доставки генетического материала в клетки растения.