Способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, полученное этим способом, и его применение (стр. 5 )

Для оценки эффективности работы разных сигнальных последовательностей сравнивали уровень накопления антител в растительном экстракте с помощью иммуноферментного анализа, измеряя количество тотального иммуноглобулина человека. Для этого использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Как следует из результатов, приведенных на Фиг. 3, наиболее оптимальным оказался вариант последовательности, содержащей сигнальный пептид тяжелой цепи антител мыши, т. к. уровень накопления антитела в растительной клетке мы оценили как 65-75 мкг/мл растительного экстракта, для других же сигнальных пептидов этот уровень колеблется от 20 до 50 мкг/мл.

Пример 4. Создание экспрессионных вирусных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении.

Для получения экспрессионных амплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали векторы на основе генома Х вируса картофеля (ХВК) и на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ). Вектор на основе ХВК содержал 35S транскрипционный промотор вируса мозаики цветной капусты, 5’-НТО ХВК, ген репликазы, первый субгеномный промотор, ген легкой цепи (SEQ ID NO:1) и 3’-НТО ХВК. Вектор на основе ВТМ содержал эукариотический транскрипционный промотор актина 2 A. thaliana (EMBL AF308778 (An et al., 1996), обеспечивающий синтез репликазы; ген репликазы крВТМ, содержащий 8 интронов и часть последовательности гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи (SEQ ID NO:2) и 3’-нетранслируемую область (НТО) крВТМ.

Для получения экспрессионного амплифицирующегося вектора на основе ХВК была создана промежуточная конструкция (ПК) 1. В плазмиду pGEM3Z (Promega), обработанную рестриктазами HindIII и SacI, были вставлены следующие фрагменты: фрагмент 1 (с 3452 нт по 4485 нт геном ХВК), фланкированный сайтами узнавания рестриктаз HindIII и XbaI, содержал часть гена полимеразы ХВК и участок субгеномного промотора, фрагмент 2 представлял собой ген легкой цепи с внесенными сайтами XbaI, BamHI и NcoI на 5'-конце и XhoI на 3'- конце, фрагментом 3 (с 6380 по 6552 нт генома ХВК), имеющим XhoI и SacI сайты на 5'- и 3'-конце, являлся 3'-концевой участок гена белка оболочки с частью 3'-нетранслируемой области. В результате была получена ПК1. Затем плазмиду PVXdt-GFP (Komarova et al., 2006) обработали рестриктазами AvrII-XhoI и перенесли в нее фрагмент из ПК1 по тем же сайтам. В результате получена плазмида рА16921 (Фиг. 4), несущая последовательность гена легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) в составе вектора на основе генома ХВК.

Для создания вектора на основе генома вируса табачной мозаики (ВТМ) (Фиг. 5) была использована кДНК ВТМ крестоцветных (Dorokhov YuL et al., 1994), в которой ген репликазы был привнесен из близкородственного вирусного штамма - вируса просветления жилок турнепса (Lartey et al., 1994). Вирусный вектор, содержащий ген тяжелой цепи антитела против Her2/neu на основе генома крВТМ был создан через ряд промежуточных конструкций. Получение ПК2. Фрагмент, фланкированный сайтами EcoRI-BamHI, из плазмиды ВТМ(и):GFP (Комарова и др., 2012) был перенесен в pGEM3Z (Promega), в результате была создана ПК2. Для получения ПК3 в ПК2 ген GFP был заменен на ген тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) по сайтам NcoI-XhoI. Затем из ПК3 фрагмент, содержащий часть гена транспортного белка крВТМ, ген тяжелой цепи и 3’-нетранслируемую область из генома крВТМ, был перенесен в плазмиду ВТМ(и):GFP (Комарова и др., 2012) по сайтам EcoRI-BamHI. В результате была получена конструкция рА16722 (Фиг. 5).

В результате были получены экспрессионные амплифицирующиеся векторы: рА16921, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 4), и рА16722, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 5), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana соответственно.

Пример 5. Продуцирование антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.

Для получения растения Nicotiana, продуцирующего антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu полученными плазмидами рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722 трансформировали клетки Agrobacterium tumefaciens, после чего осуществляли агроинфильтрацию листьев суспензией трансформированных клеток.

Для этого выращивали полученные штаммы A. tumefaciens в ночной культуре в жидкой среде LB. Ночную культуру выращивали в течение 18 часов при 28°С, затем разводили в 10-100 раз буфером для агроинфильтрации, содержащем 10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES pH 5,0. В лист вводили суспензию смеси A. tumefaciens, содержащей плазмиды, соответствующие нереплицирующимся векторам, рА16571 (Фиг. 1) и рА16671 (Фиг. 2), или реплицирующимся векторам, рА16921 (Фиг. 3) и рА16722 (Фиг. 4). Агроинфильтрацию осуществляли с помощью шприца без иглы или путем погружения растения в суспензию агробактерий с последующим созданием вакуума. При одновременной ко-инъекции векторами, кодирующими легкую и тяжелую цепь антитела, в листьях N. benthamianа синтезируются легкая (SEQ ID NO: 3) и тяжелая цепи антитела (SEQ ID NO: 4), содержащие сигнальный пептид, обеспечивающий секрецию и сборку антитела.

Пример 6. Получение и очистка антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu

Антитела, направленные против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, выделяли из растительного экстракта листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей пары плазмид рА16571 и рА16671 или рА16921 и рА16722. Для этого растительный материал, замороженный в жидком азоте, растирали до состояния пудры. К нему добавляли 4-6 объемов буфера для экстракции (200 мМ цитрат натрия, 0.1 % Tween 20, 5 мМ ЭДТА, pH 6.0). Суспензию инкубировали на льду при покачивании в течение 20-30 мин, после чего центрифугировали 5000 g х 15 мин. К осадку добавляли 2 объема буфера для экстракции и проводили повторную инкубацию на льду при покачивании в течение 20-30 мин, центрифугировали при 5000 g х 15 мин. Объединенный супернатант фильтровали через Miracloth, затем центрифугировали при 15000 g х 25 мин.

Растительные экстракты анализировали с помощью электрофореза в невосстанавливающих условиях (в отсутствие b-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.

Как следует из результатов, приведенных на Фигуре 6, в листьях N. benthamiana через 3 дня после агроинъекции нереплицирующимися векторами, рА16571 и рА16671 накапливаются полноразмерные антитела против онкогена Her2/neu. Подобный профиль мы наблюдаем и в экстрактах растений, агроинъецированных амплифицирующимися вирусными векторами, рА16722 и рА16921. Для оценки выхода антител использовали набор для определения концентрации иммуноглобулинов «IgG общий-ИФА-БЕСТ» (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. По результатам ИФА выход антител с амплифицирующихся векторов возрастает в несколько раз по сравнению с неамплифицирующимися векторами и составляет от 250 до 500 мг с кг листовой массы.

На следующем этапе растительный экстракт последовательно фильтровали через фильтры Millipore с диаметрами пор, начиная с 0,8 мкм, заканчивая 0,25 мкм и наносили на колонку с протеин A сефарозой, уравновешенной буфером, содержащем 10 мМ Na2HPO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaH2PO4, pH 8,5. Оптимальная скорость – 1 мл/мин. Экстракт наносили на колонку 2-4 раза для улучшения связывания. После нанесения, колонка промывается однократным натрий-фосфатным буфер (PBS), а затем 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6.0. Элюцию осуществляли 10 мМ NaH2PO4, pH 3, с немедленной нейтрализацией 0,4 М Na2HPO4. Для дальнейшей очистки и для удаления вирусов, ДНК и эндотоксинов была использована фильтрация «Sartobind Q нано» мембрана (Sartorius Stedim Biotech).

На Фигуре 7 представлены результаты электрофореза белков, элюированных с колонки с протеин-A сефарозой.

Для вестерн-блот анализа белков проводили их перенос на мембрану Hybond-P (GE Healthcare) в буфере для переноса (47,9 мM Трис, 38,6 мM глицин) под действием электрического тока 150 мА в течение 2 часов. Мембраны затем инкубировали с блокирующим раствором (5% обезжиренное молоко) на 1х TBS-т (1х ТBS, 0,1% Tween-20), после чего проводили инкубацию с антителами к гамма (тяжелой)-цепи или каппа (легкой)-цепи. Проявка осуществлялась системой ECL (GE Healthcare). Время экспозиции мембран с рентгеновской пленкой составляло 10-60 мин.

На Фигуре 7 представлены результаты вестерн-блот анализа растительных экстрактов листьев, инфильтрированных агробактерией, несущей плазмиды рА16571 и рА16671, с использованием антител, специфических к легкой (каппа) или тяжелой (гамма) цепи человеческих иммуноглобулинов G. Электрофоретическое разделение белков проведено в восстанавливающих условиях (в присутствии b-меркаптоэтанола). Результаты экспериментов показывают, что из 1 кг листьев N. benthamiana, агроинъецированных вирусными векторами, рА16722 (Фиг. 4) и рА16921 (Фиг. 5) можно выделить до 300-500 мг очищенных антител. В результате определения биосинтетической активностью листьев различного возраста и яруса растений N.benthamiana было выявлено, что максимального выхода 500 мг антител на 1 кг листьев удается достичь при 7-дневной инфекции и, прежде всего, в листьях 3-4 яруса растений.

Результаты препаративной очистки на колонке с протеин G сефарозой (Фиг. 6) и последующего анализа методом иммуноблота со специфическими антителами против иммуноглобулина G человека (Фиг. 7) показывают существенное накопление в трансформированном растении N. benthamiana легкой и тяжелой цепей антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.

Для биологических экспериментов препарат антител в концентрации 1 мг/мл в растворе 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,0 хранили в стерильных условиях в холодильнике при температуре 4°С.