Для экспрессии чужеродного гена в листовой ткани можно использовать метод агроинфильтрации и агроинокуляции. Трансформация растительных клеток может быть стабильной, сопровождающейся интеграцией вводимой ДНК в клеточный геном, или же временной, когда ДНК, содержащая целевой ген, находится в виде эписомы, т. е. интеграции ДНК в хозяйский геном не происходит. Временная, или транзиентная, экспрессия чужеродных генов в растительной клетке позволяет получить более высокий выход целевого белка в короткие сроки (3-14 дней). Более того, экспрессия целевых генов наблюдается через 3 часа после отправки ДНК, а уже между 18 и 48 часами достигает максимума и сохраняется на протяжении 10 дней. Очевидными преимуществами использования такой растительной «фабрики» являются простота в обращении, скорость, низкая себестоимость конечного продукта, высокий уровень продуцируемого белка, масштабируемость и возможность контроля процесса синтеза белка (Makhzoum et al., 2014).

Настоящее изобретение подразумевает предпочтительное использование транзиентной экспрессии генов легкой и тяжелой цепей МА и осуществление доставки экспрессионных векторов с помощью агроинокуляции или вакуумной агроинфильтрации.

Важным и решающим преимуществом настоящего изобретения, является то, что описываемая система синтеза антитела против онкогена Her2/neu в растении может обеспечивать высокий уровень продукции целевого белка при небольших затратах и в короткие сроки: уже на 3 день после агроинъекции нереплицирующимися векторами, содержащими ген легкой и тяжелой цепи МА, в листьях N. benthamiana накапливается до 50-80 мг/кг антител (см. Фиг. 6 Примера 6). Наши эксперименты показывают, что по результатам ИФА выход антител при использовании амплифицирующихся векторов в несколько раз больше – 250-500 мг/кг листовой массы (2.5-5% от суммарного растворимого белка клетки). С помощью аффинной хроматографии на колонке с протеином G или А можно получить чистый препарат МА против домена димеризации HER2/neu (Фиг. 7).

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Выделенные из растительного материала МА обладают способностью связывать HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, что показано с помощью проточной цитометрии (Фиг. 9).

Продуцированные и выделенные из растений МА против домена димеризации HER2/neu являются полностью функционально активными. На мышах с перевитой опухолью РМЖ человека – клетки SK-BR-3 – была подтверждена эффективность полученных в растениях антител. Продемонстрировано подавление роста опухоли при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении – фитотрастузумаб и МА против домена димеризации HER2/neu, причем эффективность этой комбинации, по крайней мере, в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Таким образом, антираковое антитело против домена димеризации HER2/neu, полученное в растительной клетке, является функционально активным, что продемонстрировано как в системе in vitro, так и in vivo, при этом по нашим оценкам себестоимость препарата МА, полученного в клетке растения, может быть в 10-20 раз ниже стоимости аналогичного препарата, полученного из животных клеток.

Не менее существенным преимуществом данного изобретения является то, что на протяжении всего цикла получения МА из растительной клетки не используются какие-либо материалы животного происхождения, что гарантирует отсутствие вирусов или их генетического материала, прионов и прочих инфекционных агентов в получаемом продукте.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Данное изобретение подробно проиллюстрировано ниже со ссылками на конкретные примеры, представляющие собой его наиболее предпочтительные воплощения.

Пример 1. Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей легкую и тяжелую цепи антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенной для экспрессии в клетках растения рода Nicotiana получали на основе опубликованной в драгбанке (DrugBank accession number DB06366) аминокислотной последовательности антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/ с помощью инструмента «обратной трансляции» с одновременной оптимизацией кодонового состава для экспрессии в растениях рода Nicotiana (http://www. entelechon. de/2008/10/backtranslation-tool/). К каждой последовательности с N-конца была добавлена аминокислотная последовательность сигнального пептида тяжелой цепи антител P01749 (HVM05_MOUSE) Mus musculus. Аминокислотная последовательность тяжелой или легкой цепи вводилась в соответствующее поле сервиса «обратная трансляция», затем устанавливались следующие параметры: стандартный генетический код; таблица частоты использования кодонов для рода Nicotiana с включенным условием использования наиболее часто встречающихся кодонов; в качестве нежелательных мотивов были указаны сайты узнавания рестриктазами NcoI, XhoI, которые в дальнейшем использовались для получения генноинженерных конструкций. Выведенные нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела, направленного против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, предназначенные для экспресии в клетках растения рода Nicotiana представлены в (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2) соответственно. По заказу авторов эти последовательности были синтезированы ЗАО «Евроген», каждая из них была вставлена в вектор pAL-TA (Евроген, Россия), причем на 5’-конце каждой из последовательностей был добавлен сайт узнавания рестриктазой NcoI, а на 3’-конце – XhoI. В результате были получены конструкции pAL-L и pAL-H, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.

Пример 2. Создание экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana.

Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов для продукции антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana использовали имеющиеся в распоряжении авторов настоящего изобретения бинарный вектор на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия) содержащий в качестве транскрипционного промотора конститутивный (Arce et al., 2008) транскрипционный промотор. В одном из вариантов рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. В другом варианте рекомбинантного экспрессионного вектора согласно изобретению использовали конститутивный транскрипционный промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana. В качестве терминатора транскрипции использовали 35S-терминатор вируса мозаики цветной капусты или nos-терминатор Agrobacterium tumefaciens. Между последовательностью промотора и терминатора была помещена последовательность, кодирующая легкую (SEQ ID NO: 1) или тяжелую (SEQ ID NO: 2) цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.

Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиды на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащие 35S-промотор и 35S-терминатор транскрипции, по сайтам рестрикции NcoI-SalI из плазмид pAL-L и pAL-H были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, соответственно.

В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы: рА16571, содержащий ген легкой цепи антитела (SEQ ID NO: 1) (Фиг. 1), и рА16671, содержащий ген тяжелой цепи антитела (SEQ ID NO: 2) (Фиг. 2), продуцирующие легкую и тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu в растении Nicotiana, соответственно.

Пример 3. Определение оптимальной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопласт

Для определения наиболее эффективной сигнальной последовательности для доставки цепей антител в апопласт проводили сравнение нескольких сигнальных последовательностей (Табл. 1).

Для этого ЗАО «Евроген» по заказу авторов были синтезированы последовательности, кодирующие легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащие с 5’-конца последовательности, кодирующие приведенные в таблице 1 сигналы апопластной локализации. Для получения экспрессионных неамплифицирующихся векторов в плазмиду на основе pCambia 1300 (Cambia, Австралия), содержащую 35S-промотор и 35S-терминатор транскрипции, обработанную рестриктазами NcoI/SalI из плазмид, содержащих последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, были перенесены фланкированные сайтами NcoI-XhoI последовательности, кодирующие сигнальный пептид и легкую или тяжелую цепь антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.

В результате были получены экспрессионные неамплифицирующиеся векторы, перечисленные в таблице 1.

Таблица 1. Список тестируемых сигнальных последовательностей, направляющих антитело в апопласт

№ дорожки

Белок-источник

Организм

Аминокислотная последовательность

Название конструкции (для ЛЦ/

для ТЦ)

1

Нет сигнальной последовательности

pA-L-cyt /

pA-H-cyt

2

Пектиназа/ Полигалактуроназа

Malus domestica

MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG

pA-L-pec /

pA-H-pec

3

Кальретикулин

Nicotiana plumbagenifolia

MATQRRANPSSLHLITVFSLLVAVVSA

pA-L-cal /

pA-H-cal

4

Ингибитор альфа-амилазы

Phaseolus vulgaris

MIMASSKLLSLALFLALLSHALG

pA-L-iaa /

pA-H-iaa

5

Эндохитиназа A2

Pisum sativum

MSKLRIPILLVLFIVSCCSG

pA-L-ea2 /

pA-H-ea2

6

Альфа-амилаза

Oryza sativa

MGKQMAALCGFLLVALLWLTPDVAHG

pA-L-aa /

pA-H-aa

7

Ауксин-связывающий белок 1

Arabidopsis thaliana

MIVLSVGSASSSPIVVVFSVALLLFYFSETSLG

pA-L-abp /

pA-H-abp

8

Тяжелая цепь антител P01749 (HVM05_MOUSE)

Mus musculus

MGWSCIILFLVATATGVHS

рА16571 / рА16671

Растения Nicotiana benthamiana совместно инфильтрировали полученными векторами в следующих комбинациях: 1. pA-L-cyt + pA-H-cyt; 2. pA-L-pec + pA-H-pec; 3. pA-L-cal + pA-H-cal; 4. pA-L-iaa + pA-H-iaa; 5. pA-L-ea2 + pA-H-ea2; 6. pA-L-aa + pA-H-aa; 7. pA-L-abp + pA-H-abp; 8,9. рА16571 + рА16671. Затем через 5, 7 и 9 дней после инфильтрации собирали растительный материал, получали экстракт суммарного растворимого белка и аликвоту наносили на 7.5% полиакриламидный геле (ПААГ) в отсутствие бета-меркаптоэтанола. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем ПААГ проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970) по следующей схеме. К препарату, содержащему анализируемый белок, добавляли 2-3 объема буфера для нанесения на ПААГ, содержащего 60% глицерин, 10% ДСН, 1% бромфеноловый синий и 0,25 М Трис-HCl, рН 6,8, после чего пробу прогревали 3-10 мин при 95°С. Электрофорез проводили в ПААГ в приборе фирмы "Bio-Rad". Верхний (концентрирующий) гель с рН 6,8 содержал 3% акриламид, 0,08% N, N'-метиленбисакриламид, 0,125 М Трис-HCl и 0,1% ДСН. Нижний (разделяющий) гель с рН 8,8 содержал 7,5% или 12% акриламид и 0,075 или 0,12% N, N'-метиленбисакриламида соответственно, 0,4 М Трис-HCl и 0,1% ДСН. Пробы вносили в лунки верхнего геля. В качестве стандартов молекулярной массы использовали наборы маркерных белков фирм ThermoScientific (10-250 кДа). Электрофорез проводили в приборе фирмы "Bio-Rad" в трис - глициновом буфере, рН 8,4 (25 мМ Трис, 0,192 М глицин, 0,1% ДСН) при постоянном токе 10 мА на гель в приборе фирмы "Bio-Rad". Гель окрашивали Кумасси G-250 в течение 20 мин, затем отмывали. На Фигуре 3 приведены результаты электрофореза растительных экстрактов в невосстанавливающих условиях (в отсутствие b-меркаптоэтанола) в 7,5% полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8