Способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, полученное этим способом, и его применение (стр. 6 )

Пример 7. Взаимодействие антитела против домена димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, продуцированного в растении N. benthamianа с раковыми клетками SK-BR-3.

Аффинность рекомбинантных моноклональных антител против домена димеризации HER2/neu, продуцированных в растении, к антигену HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3, проводили с помощью проточной цитометрии. Для этого из каждой лунки 96-ячеечной платы было собрано 5x105 клеток SKBR-3. Клетки промывал дважды 1хPBS и далее инкубировали в течение 30 мин при 4°C с рекомбинантными моноклональными антителами против домена димеризации HER2/neu, продуцированными в растении. Клетки затем три раза промывали 1хPBS, после чего инкубировали в PBS с добавлением 0,1% БСА, содержащем конъюгированные с FITC иммуноглобулины, специфичные к человеческому IgG. Клетки инкубировали с антителами в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл с последующей оценкой доли связавшихся с антителами клеток. Каждое разведение антител было протестировано в трех повторностях. Результаты приведены на Фиг. 9. Как следует из приведенных результатов, антитело, полученное в N. benthamianа, является полностью функциональным и способно специфически узнавать онкобелок HER2/neu на поверхности опухолевых клеток SK-BR-3, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии онкогена HER2/neu.

Пример 8. Подавление роста HER2/neu позитивных опухолей у мышей с подкожными ксенографтами рака молочной железы человека SK-BR-3 при использовании комбинации двух антител против HER2/neu, продуцированных в растении.

Для этой работы было проведено разведение и содержание в бестимусном отсеке половозрелых мышей-самок Balb/c nude для трансплантации опухолевого материала. Мышей содержали в специализированном бестимусном отсеке (зона SPF) в макролоновых клетках с твердым основанием, аксессуарами и аэросистемой (бумажный фильтр, бутылка внутри, Cage Type II – Hood of open design) фирмы EHRET GNBA (Германия) со свободным доступом к воде. Для разведения и содержания мышей использованы:

·  подстилка из бумаги ГОСТ 8273-75 (пищевая), нарезанной с помощью бумагорезательной машины BLS-272 и шреддера Kobra 240 S4 (Германия) и стерилизованная в стерилизаторе для бумаги ВК75-01;

·  экструзированный гранулированного корма («МЭСТ», РФ) соответствующей пищевой ценности для разведения и содержания мышей, стерилизованный в сухожаровом шкафу;

·  питьевая вода, стерилизованная в сухожаровом шкафу.

В день начала опыта всех мышей взвешивали на электронных весах МW-T series, User’s Manual (фирма CAS, США), цена деления 0,01 г под контролем стандартной динамики прироста массы тела. Для введения в эксперимент мышей перед началом лечения делили на группы по 10 особей. После завершения экспериментов мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствии с методами гуманного обращения в лабораторными животными, принятыми в РФ и за рубежом.

Получение донорского прививочного материала включало выполнение двух пассажей клеток SK-BR-3 на бестимусных мышах. Использовали штамм перевиваемого рака молочной железы человека SK-BR-3 из Коллекции штаммов опухолей человека РОНЦ им. . Перевиваемый рак молочной железы человека SK-BR-3 представляет собой аденокарциному, содержащую на своей поверхности до 8х105 рецепторов HER2/neu на клетку. Использованная в данном исследовании культура клеток также была проверена на наличие экспрессии поверхностного антигена Her2/neu методом цитофлюорометрии. Эта линия клеток формирует подкожные ксенографты у nude мышей и отличается отсутствием рецепторов эстрогенных и прогестероновых гормонов. В связи с этим, для ее трансплантации и роста не требуется создания гормонального фона, резко сниженного у мышей nude

Для получения мышей-ксенографтов взвесь опухоли размораживали после хранения стандартным методом, затем содержимое каждой ампулы имплантировать мышам подкожно по 0,5 мл (3 млн клеток на мышь в 0,1 мл питательной среды) на мышь. Полученные опухолевые узлы (1-й пассаж, n=5) были использованы в качестве донорского материала для трансплантации. Инокулят для опыта готовили по стандартной методике и трансплантировали по 60 мг взвеси на мышь (2-й пассаж, n=20). На 6-е сутки после трансплантации, когда опухолевые узлы появляются у всех мышей (100% прививаемость), измеряли объемы опухолей, после чего животных ранжировали на 2 группы (контроль и опыт) по 10 мышей так, чтобы средний объем опухолей в каждой из групп составил 41±15,5 мм3. Группа контроля не получала специфического лечения, животным проводили внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора в режиме, аналогичном исследуемому агенту. Другая контрольная группа получала лечение Фитотрастузумабом. Опытная группа получала лечение при совместном введении фитотрастузумаба и антитела против домена димеризации (АПДД) HER2/neu, которое начинали вводить на 5 сутки после трансплантации внутрибрюшинно курсом по аналогичной фитотрастузумабу схеме: 1-я инъекция в дозе 20 мг/кг, остальные 8 инъекций через 48 часов в разовой дозе 10 мг/кг. Длительность курса лечения - 16 дней, курсовая доза – 100 мг/кг. Таким образом, введение АПДД HER2/neu совместно с Фитотрастузумабом осуществляли внутрибрюшинно одновременно всем мышам последовательно на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 сутки после трансплантации опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по общепринятому показателю торможению роста опухоли (ТРО). Для вычисления показателя ТРО с помощью электронного измерителя многократно в процессе и после лечения измеряли опухолевые узлы и рассчитывали средние объемы (Vcp) в каждой группе. Для контроля стандартности опухолевой модели в процессе роста определяли скорость роста опухолевых узлов по соотношению средних объемов к исходному (Vt/Vo). Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием доверительных интервалов средних сравниваемых величин, рассчитанных по стандартному методу Стьюдента в модификации . Достоверными считаются различия при p<0,05. Наблюдение проводили в течение 30-ти дней после трансплантации опухолей, после чего животных умертвляли передозировкой эфирного наркоза в рамках правил гуманного обращения с лабораторными животными. Результаты одновременного использования двух антител против онкобелка HER2/neu, продуцированных в растении, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты сочетанного применения препаратов Фитотрастузумаб и АПДД HER2/neu на подкожных ксенографтах

рака молочной железы человека SK-BR-3 Her2+

Группа*, показатель эффективности	Доза	Средний объем опухоли (мм3) на сутки роста	Т/С% на сутки после лечения***
V0	Vt1	Vt2	Vt3
Разовая	Сум-марная	5	22**	28	31	1	7	10
1-я инъекция	Послед. инъекции
КРО, физ. р-р	0,4 мл	0,2 мл	1,8 мл	34±6#	704±137	1083±218	1410±384	100	100	100
Фитотрастузумаб**	20 мг/кг	10,0 мг/кг	100 мг/кг	313±67	644±170	942±313	45##	59##	67
Фитотрастузумаб + АПДД HER2/neu	20 мг/кг	10,0 мг/кг	100 мг/кг	144±34	380±90	575±95	21###	35##	41##

Примечание: *в каждой группе 8 мышей и 16 опухолей; **Лечение внутрибрюшинно одновременно последовательно на 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 сутки роста опухоли; ***22, 28 и 31 сутки роста; критерий Т/С<42%; #средняя арифметическая со стандартным отклонением; V0 – стартовый средний объем опухоли; Vt – средний объем опухоли на сроки после лечения; Различия достоверны (p<0,05): ##с группой КРО; ###между группами Фитотрастузумаб и Фитотрастузумаб+ АПДД Her2/neu.

Видно, что без лечения на 22, 28 и 31 дни после имплантации опухоль достигает средних объемов Vcp=704±137 мм3, 1083±218 мм3 и1410±384 мм3. На эти сроки (10 дней) кратность увеличения опухолей составила, соответственно Vt1-3/V0=20,7 – 31,9 – 41,5. За весь период роста в группе КРО опухолевые узлы увеличились боле чем в 40 раз.

В основной группе, получившей сочетание Фитотрастузумаб и АПДД Her2/neu, средний объем и кратность увеличения опухоли на все сроки после окончания лечения были достоверно меньше контрольных.

Из таблицы 2 видно, что наиболее эффективное достоверное (р<0,05) подавление роста опухоли наблюдается при использовании комбинации двух моноклональных антител, продуцированных в растении – фитотрастузумаб и АПДД HER2/neu, причем эффективность этой комбинации по крайней мере в два раза выше, чем одного фитотрастузумаба. Сравнение с группой Фитотрастузумаба показало достоверный почти двукратный терапевтический выигрыш. Соответственно, показатели эффективности по срокам измерения составили в группе с сочетанием Фитотрастузумаб + АПДД Her2/neu против группы Фитотрастузумаба (Таблица 3):

Т/С=21, 35 и 41% (p<0,05) против Т/С=45 и 59 (p<0,05);

Vt1-3/V0=4,2 – 11,2 – 16,9 против Vt1-3/V0= 9,3 – 18,9 – 27,7.

Переносимость лечения во всех группах мышей была удовлетворительной. Состояние и поведение мышей было в пределах физиологической нормы, гибели от токсичности не отмечали.

Таблица 3. Сравнительная кратность увеличения опухолевых узлов в динамике у мышей Balb/c nude с подкожными ксенографтами SK-BR-3 Her2+ после сочетанного применении препаратов Фитотрастузумаб и АПДД Her2/neu (см. таблицу 2).