Для определения влияния природного субстрата в лаборатории бактериологии и молекулярных методов ИЭЦ использовали растительные экстракты различных растений-хозяев с пороговыми/пограничными положительными концентрациями возбудителя, согласно пункту 1.2.2, определенные в результате изучения аналитической чувствительности диагностической системы. В опыте использованы 18 экстрактов вегетативных частей растений-хозяев, полученных в результате проведения лабораторной экспертизы: груши (Prunus communis), яблони (Malus domestica), боярышника (Crataegus sanguinea), кизильника (Cotoneaster melanocarpa), рябины (Sorbus aucuparia), айвы (Cydonia oblonga), аронии черноплодной (Aronia melanocarpa), малины (Rubus idaeus), роз (Rosa rugosa), спиреи (Spirea japonica), черемухи (Padus racemosa), ирги (Amelanchier ovalis), лапчатки (Pentaphylloides fruticosa), пузыреплодника (Physocarpus opulifolius), земляники (Fragaria vesca), сливы (Prunus domestica), вишни (Cerasus vulgaris) и черешни (Cerasus avium). Были приготовлены 3 серии (повторности) экстрактов вегетативных частей растений, перечисленных выше, с концентрацией патогена 102, 103 и 104.
Изоляты и штаммы бактерийДля изучения аналитической чувствительности, повторяемости, воспроизводимости и селективности использовали референтный штамм E. amylovora 0172 (CFBP 1430) из бактериологической коллекции ФГБУ «ВНИИКР», полученный из Института аграрных исследований (Валенсия, Испания).
Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения аналитической специфичности испытуемой диагностической тест-системы необходимо провести анализ (во-первых) штаммов целевой бактерии, учитывая генетическое разнообразие, разное географическое происхождение и растений-хозяев и (во-вторых) ряда нецелевых бактерий, в частности, бактерий, которые могут присутствовать в образцах. Рекомендуется использовать суспензии клеток чистых культур в соотношении, приблизительно 106 КОЕ/мл.
Также дополнительно результаты теста могут быть подтверждены компьютерным (in silico) сравнением последовательностей праймеров/зонда с последовательностями геномных библиотек.
Для определения специфичности были использованы более 120 штаммов вида E. amylovora, выделенных при проведении экспертизы в лаборатории бактериологии и молекулярных методов ИЭЦ ФГБУ «ВНИИКР», штаммы видов E. billingae, E. tasmaniensis, E. piriflorinigrans, присутствие которых возможно в растительных экстрактах. Также для изучения специфичности была использована ДНК видов Erwinia pyrifoliae и Erwinia uzenensis, полученная в рамках рабочего блока 2 («оценка рабочих характеристик теста» Erwinia sp.), проекта Phytfire («Фитосанитарная диагностика, выявление в полевых условиях и эпидемиология Erwinia amylovora») Европейской организацией координирования фитосанитарных исследований EUPHRESCO II (http://www. ). Кроме материала, описанного выше, для определения специфичности использовали более 80 штаммов нецелевых видов бактерий из коллекции ФГБУ «ВНИИКР», выделенных из различных растительных образцов при проведении бактериологической экспертизы, штаммы, полученные из лабораторий Ленинградского и Краснодарского референтных центров Россельхознадзора, а также приобретенные и полученные из европейских коллекций (Приложение 1).
Выделение ДНК из растительных экстрактов
Выделение ДНК из растительных экстрактов проводили при помощи коммерческого набора «Проба-ГС» для выделения ДНК из растительной ткани в соответствии с инструкций производителя. Метод основан на использовании для лизиса клеток гуанидин тиоционата (GuSCN) с последующей сорбцией ДНК на носителе: стеклянные бусы, диатомовая земля и т. д. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она снимается элюирующим раствором.
Выделение ДНК из чистых культур для определения аналитической специфичности диагностической системы проводили методом кипячения, для этого бактериальную культуру суспендировали в 200 мкл фосфатного буфера, далее микропробирки с образцами инкубировали 10 мин при 98 оС в твердотельном термостате, охлаждали 5 мин в морозильной камере, центрифугировали 3 мин при 7000 об/мин, проводили амплификацию.
Постановка классической ПЦР
Для проведения классической ПЦР были использованы следующие праймеры, синтезированные в «Химэксперт», разработанные на основе участка плазмиды pEA29 (Stцger et al., 2006):
PEANT 1 5’ – TATCCCTAAAAACCTCAGTGC – 3
PEANT 2 5’ – GCAACCTTGTGCCCTTTA – 3
Основные исследования проводили в термоциклере VeritiTM (Applied Biosystems, США). При составлении реакционных смесей использовали готовые окрашенные 5х ПЦР-МастерМиксы (5x ScreenMix-HS) компании , состав смесей и условия проведения ПЦР представлены в таблице 1. Размер ампликона составляет 391 п. о. Окончательный объем реакционной смеси составлял 20 мкл.
Таблица 1
Состав реакционных смесей и условия амплификации
для постановки классической ПЦР
Компоненты | Объем (V), мкл | Конечная концентрация |
Ультрачистая вода | 11,0 | - |
5х ПЦР-буфер | 4,0 | 1x |
MgCl2 (25 mM) | Включено в Master Mix | Включено в Master Mix |
d-NTP (25 mM) | Включено в Master Mix | Включено в Master Mix |
Taq-полимераза | Включено в Master Mix | Включено в Master Mix |
Прямой праймер (10 рM/µl) | 0,5 | 250 нМ |
Обратный праймер (10 рM/µl) | 0,5 | 250 нМ |
ВК ЭФ (10х) | 2,0 | 1x |
праймер Mus 714F (10 pmol/µl) | Включено в 10x ВК ЭФ | Включено в 10x ВК ЭФ |
праймер Mus 714R (10 pmol/µl) | Включено в 10x ВК ЭФ | Включено в 10x ВК ЭФ |
плазмида Mus 714_6 (10 нг/µl) | Включено в 10x ВК ЭФ | Включено в 10x ВК ЭФ |
ДНК образца | 2,0 | - |
Объем реакции | 20,0 | - |
Условия амплификации классической ПЦР | ||
Температура, оС | Время | Количество циклов |
96 | 15 мин | 1 |
95 | 15 с | 35 |
58 | 30 с | |
72 | 45 с | |
72 | 5 мин | 1 |
В качестве внутреннего контроля, позволяющего оценить корректность постановки реакции и отсутствие ингибиторов, использовали систему внутреннего контроля на основе гена мыши, встроенного в вектор (Мазурин и др., 2012). Внутренний контроль состоял из плазмидного вектора и праймеров, размер ампликона составляет 714 п. о.:
Mus 714F 5’ – CTTCTGGCGTTTCAGAGACC – 3
Mus 714R 5’ – GGCTCCTCTTGTGCAGATTC – 3
В пробирке одновременно проходят две реакции – амплификация специфического фрагмента генома патогенного организма и ДНК внутреннего контроля. Количество матрицы для внутреннего контроля подобрано так, чтобы не ингибировать амплификацию специфического фрагмента, поэтому при высокой концентрации специфической матрицы синтез внутреннего контроля может отсутствовать.
При испытании воспроизводимости амплификация проводилась разными специалистами в разные дни, на следующих термоциклерах: VeritiTM (Applied Biosystems, США), Mastercycler personal (Eppendorf, Германия), C1000 Touch (BioRad, США). Результаты реакции амплификации регистрировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Molecular ImagerGel Doс XR (BioRad, США). Размер продукта ПЦР измеряли, используя маркеры молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п. н. и Fast Ruler™ (Fermentas). При проведении электрофореза использовали камеры производства «Хеликон» (Россия), источник напряжения Эльф («ДНК-технология») со следующими параметрами: 115 В, 165 мА, 40 Вт.
2. Результаты тестирований и обсуждение
2.1. Определение стандартной базовой суспензии культуры E. amylovora
Результаты постановки метода серийных разведений описанного в п. 1.2.1, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Получение стандартной базовой суспензии E. amylovora
№ разведения | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
Колоний на чашке Петри | газон | газон | газон | газон | 602 | 66 | 9 | - |
КОЕ/мл | 107 | 106 | 105 | 104 | 103 | 102 | 101 | 100 |
КОЕ/мл растительного экстракта | - | 6,0 х 106 | 6,0 х 105 | 6,0 х 104 | 6,0 х 103 | 6,6 х 102 | 9,0 х 101 | 9,0 х 100 |
Концентрация копий мишени в субобразце (200 мкл) | - | 1,2*106 | 1,2*105 | 1,2*104 | 1204 | 132 | 18 | - |
Минимальное количество копий мишени ДНК (2 мкл) | - | - | - | - | ≈ 24,1 | ≈ 2,6 | ≈ 0,4 | - |
Из таблицы 2 видно, что искомая базовая стандартная концентрация 107 КОЕ/мл была получена в нулевом разведении.
2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности
Результаты подготовки растительных экстрактов с различным уровнем зараженности представлены в таблице 2. Приведенные данные показывают, что концентрация патогена в растительных экстрактах составила 9,0*100, 9,0*101, 6,6*102, 6,0*103, 6,0*104, 6,0*105, 6,0*106 КОЕ/мл, соответственно, дальнейшая концентрация возбудителя в субобразцах (200 мкл) № 1-6 составила: 1,8*101, 1,3*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106. Минимальное количество копий мишени в 2 мкл ДНК для постановки ПЦР составило ≈ 0,4*100, 2,6*101, 24,1*102, 1,2*103, 1,2*104, 1,2*105, 1,2*106.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
