Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со STЦGER ET AL., 2006) (стр. 3 )

2.3. Аналитическая чувствительность

В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения аналитической чувствительности необходимо проанализировать как минимум 3 серии (повторности) образцов зараженных растительных экстрактов в соотношении 100-106 клеток целевого организма на миллилитр.

Серии образцов зараженных растительных экстрактов подготовлены в соответствии с п. 1.2.2, результаты определения аналитической чувствительности представлены таблице 3.

Таблица 3

Результаты определения чувствительности классической ПЦР

для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте

(в соответствии со Stцger et al., 2006)

с использованием коммерческого набора «Проба-ГС»

Метод выделения/ Разведение (КОЕ/мл)	«Проба-ГС»
106	Серия	1	2	3
Результат ВК	+	+	+
Результат спец	+	+	+
105	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	+	+	+
104	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	+	+	+
103	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	+	+	+
102	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	+	–	+
101	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	–	–	–
100	Результат ВК	+	+	+
Результат спец	–	–	–
К- выделения	Результат ВК	+
Результат спец	–
К- чистая зона	Результат ВК	+
Результат спец	–

Из результатов, представленных в таблице 3, видно, что чувствительность метода с использованием коммерческого набор «Проба-ГС» позволила выявить возбудителя ожога плодовых в концентрации 103 КОЕ/мл во всех трех сериях (100%), возбудителя в концентрации 102 КОЕ/мл в двух сериях из трех (66,66%).

2.4. Аналитическая специфичность

Сведения о специфичности диагностической системы классического ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006) представлены в таблице 4. Полная информация о штаммах, использованных для определения аналитической специфичности, а также результаты классического ПЦР представлены в Приложении 1.

Таблица 4

Результаты определения специфичности метода ПЦР «в реальном времени» для возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. (в соответствии с Stцger et al., 2006)

Вид бактерии (штаммы/изоляты), происхождение	Количество исследованных штаммов	Реакция с системой
Erwinia amylovora
Тамбовская область	16	+
Самарская область	12	+
Волгоградская область	8	+
Воронежская область	10	+
Саратовская область	2	+
Липецкая область	14	+
Калининградская область	13	+
Ставропольский край	8	+
Белгородская область	1	+
Пензенская область	9	+
Кабардино-Балкарская Республика	5	+
Карачаево-Черкесская Республика	1	+
Всего	99
Штаммы Erwinia amylovora из зарубежных коллекций
Республика Казахстан	18	+
Республика Молдова	2	+
Французская Республика	1	+
Республика Польша	6	+
Всего	27
Erwinia sp.
Erwinia billingiae	1	-
Erwinia tasmaniensis	1	-
Erwinia piriflorinigrans	2	-
Erwinia uzenensis	1	-
Erwinia pirifoliae	1	-
Всего	6
Ralstonia solanacearum
Арабская Республика Египет	32	-
Республика Индия	4	-
Китайская Народная Республика	4	-
Народная Республика Бангладеш	1	-
Московская область	6	-
Штаммы из зарубежных коллекций	4	-
Всего	51
Иные виды
Ochrobacterium sp.	1	-
Rahnella aquatilis	1	-
Pseudomonas congelans	1	-
Curobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens	1	-
Enterobacter amnigenus	1	-
Ochrobactrum anthropi	1	-
Artrobacter castelli	1	-
Acidovorax citrulli	3	-
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	1	-
Pectobacterium atrosepticum	2	-
Pantoea stewartii subsp. stewartii	8	-
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus	4	-
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis	1	-
Xilophilus ampelinus	3	-
Dickeya sp.	3	-
Xanthomonas fragaria	1	-
Xanthomonas campestris pv. raphani	1	-
Xanthomonas arboricola pv. pruni	1	-
Всего	35

Проведенный эксперимент выявил высокую специфичность системы Классической ПЦР к Erwinia amylovora. При тестировании штаммов данного вида специфичная реакция наблюдалась во всех случаях со 126 штаммами (приложение 1). Высокая специфичность ПЦР системы также была отмечена как по отношению к нецелевым видам, так и по отношению к другим видам рода Erwinia, поражающим растения сем. Розовые (Rosбceae) в азиатских странах (Erwinia pyrifoliae, Kim et al., 2001), Erwinia uzenensis (Matsuura et. al., 2012) и вызывающим некротизацию цветков в некоторых странах Европы (Erwinia pyriflorinigrans, Lopez et al., 2011), а также видам, не являющимся фитопатогенами (Erwinia billingiae, Erwinia tasmaniensis).

В эксперименте не было зарегистрировано ни одного случая ложноположительной либо ложноотрицательной реакции.

Подтверждение специфичности последовательностей праймеров ‘in silico’ проводили путем сравнения последовательностей с геномными библиотеками. Сравнительный анализ последовательностей праймеров, разработанных на основе участка плазмиды pEA29 осуществляли с помощью базы данных Генбанка – пакета NCBI BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST). На рисунках 2 и 3, приведены результаты сходства последовательностей прямого, обратного праймеров с полными и частичными геномами организмов, депонированных в данный ресурс. Во всех приведенных на рисунках результатах 100% покрытия и идентичности последовательностей праймеров было получено с более чем 30 геномами штаммов вида Erwinia amylovora (включая референтный штамм CFBP 1430), комплементарность праймеров к участкам генома каких-либо нецелевых организмов не выявлена.

Рис. 2. Результат сравнения прямого праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stцger et al., 2006)

с базой данных ГенБанка (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)

Рис. 3. Результат сравнения обратного праймера для классической ПЦР (в соответствии с Stцger et al., 2006)

с базой данных ГенБанка (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)

2.5. Селективность

При изучении селективности ДНК растительных экстрактов различных растений-хозяев возбудителя была выделена при помощи коммерческого набора «Проба-ГС» , метода, выбранного в результате определения чувствительности диагностической системы. Полученные результаты изучения селективности диагностической системы представлены в таблице 5.