Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со STЦGER ET AL., 2006) (стр. 5 )

Слабый, но визуально регистрируемый результат, при концентрации возбудиКОЕ/мл, был получен практически во всех случаях, за исключением растительных экстрактов груши, черемухи, ирги, пузыреплодника. Положительный результат по внутреннему контролю зарегистрирован во всех без исключения тестовых образцах.

2.6. Повторяемость

Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, для определения повторяемости необходимо проанализировать как минимум 3 серии (повторности) образцов растительных экстрактов с низким уровнем зараженности, если после трех серий не получены стабильные результаты, следует подготовить дополнительные серии и провести их анализ.

В наших исследованиях были специально протестированы 6 серий образцов с концентрацией возбуди, 103 (низкий уровень зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности), а также использованы данные, полученные при изучении чувствительности. Результаты определения повторяемости представлены в таблице 6.

Таблица 6

Результаты определения повторяемости метода Классической ПЦР

для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте

(в соответствии со Stцger et al., 2006)

Результаты	Серия	104	103	102
РезультатВК	Результатсп	Результат	РезультатВК	Результатсп	Результат	РезультатВК	Результатсп	Результат
Определения чувствительности п. 2.3	1	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2	+	+	+	+	+	+	+	–	–
3	+	+	+	+	+	+	+	+	+
К - (выделения ДНК)	Ctспец	–
CtВК	+
Результат	–
К - (Чистая зона)	Ctспец	­–
CtВК	+
Результат	–
Определения повторяемости	1	+	+	+	+	+	+	+	–	–
2	+	+	+	+	+	+	+	–	–
3	+	+	+	+	+	+	+	–	–
4	+	+	+	+	+	+	+	–	–
5	+	+	+	+	+	+	+	–	–
6	+	+	+	+	+	+	+	–	–
К - (Чистая зона)	Ctспец	–
CtВК	+
Результат	–
К - (Зона внесения ДНК)	Ctспец	–
CtВК	+
Результат	–
Итого	9 из 9	9 из 9	2 из 9
100%	100%	22,2

Повторяемость метода классического ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006) со средним и низким уровнем зараженности (104  и 103) составила 100%, с уровнем зараженности возбудителем в концентрации 102 КОЕ/мл повторяемость составила 22,2%.

2.7. Воспроизводимость

Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98, эксперимент по оценке воспроизводимости проводится по такой же методике, что и определение повторяемости, но другими операторами, в другие сроки и по возможности на другом оборудовании.

В нашем эксперименте были специально протестированы 6 серий образцов с концентрацией возбуди, 103 (низкий уровень зараженности) и 104 КОЕ/мл (средний уровень зараженности). Постановку классической ПЦР проводили 3 специалиста на оборудовании, указанном в п. 1.5, полученные результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты определения воспроизводимости метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте

(в соответствии со Stцger et al., 2006)

Серия/Разведение (кое/мл) Дата проведения, название прибора	Серия	104	103	102
РезультатВК	РезультатСП	Результат	РезультатВК	РезультатСП	Результат	РезультатВК	РезультатСП	Результат
14 ноября, термоциклер C1000 Touch Thermal Cycler (BioRad, США), специалист	1	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2	+	+	+	+	+	+	+	+	+
3	+	+	+	+	+	+	+	+	+
4	+	+	+	+	+	+	+	+	+
5	+	+	+	+	+	+	+	–	–
6	+	+	+	+	+	+	+	+	+
К - (Чистая зона)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
К - (Зона внесения ДНК)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
12 ноября, термоциклер Veriti (Applied Biosystems, США), специалист	1	+	+	+	+	+	+	+	+	+
2	+	+	+	+	+	+	+	+	+
3	+	+	+	+	+	+	+	+	+
4	+	+	+	+	+	+	+	–	–
5	+	+	+	+	+	+	+	–	–
6	+	+	+	+	+	+	+	–	–
К - (Чистая зона)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
К - (Зона внесения ДНК)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
13 ноября, термоциклер Mastercycler personal (Eppendorf, Германия), специалист	1	+	+	+	+	+	+	+	–	–
2	+	+	+	+	+	+	+	+	+
3	+	+	+	+	+	+	+	–	–
4	+	+	+	+	+	+	+	–	–
5	+	+	+	+	+	+	+	–	–
6	+	+	+	+	+	+	+	–	–
К - (Чистая зона)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
К - (Зона внесения ДНК)	Результат ВК	+
Результат СП	–
Результат	–
Итого	18 из 18	18 из 18	9 из 18
100%	100%	50%

Воспроизводимость результатов теста оказалась абсолютной (100%) для образцов с зараженностью 103 и 104 КОЕ/мл и низкой (50%) для образцов с зараженностью 102 КОЕ/мл.