Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со STЦGER ET AL., 2006) (стр. 6 )

Выводы

Аналитическая чувствительность метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006) составила не менее 102-103 КОЕ/мл. Установлена высокая специфичность метода классической ПЦР к виду Erwinia amylovora. Влияние природного субстрата отмечено при тестировании растительного экстракта груши, ирги. Предел детекции возбудителя в данных растительных экстрактах составляет 104 КОЕ/мл. При тестировании остальных растительных экстрактов, с концентрацией возбудиКОЕ/мл влияние природного субстрата на эффективность выявления не отмечено. Слабый, но визуально регистрируемый результат при концентрации возбудиКОЕ/мл был получен практически во всех случаях, за исключением растительных экстрактов груши, черемухи, ирги, пузыреплодника. Проведенные испытания свидетельствуют о высокой повторяемости и воспроизводимости результатов при использовании данного метода.

Заключение

Проведена валидация метода классической ПЦР с диагностической системой для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006), согласно Стандарту ЕОКЗР PM 7/98 (2) (OEPP/EPPO Bulletin 44 (2)). Метод характеризуется высокой аналитической чувствительностью и специфичностью, обладает селективностью по отношению к растительным экстрактам груши и ирги, обеспечивает высокий уровень повторяемости и воспроизводимости результатов и может быть рекомендован для проведения лабораторной экспертизы по выявлению и идентификации этого карантинного организма.

Список литературы

Европейская ассоциация по аккредитации/EA (2008) EA-2/15 «Требования для гибкой аккредитации», http://www. eurolab. org/docs/EA/EA-2_15.pdf. Мазурин достоверности результатов фитосанитарной экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики / , , // Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство. – 2012. – №3. – С. 31-38. Стандарт ЕОКЗР PM 7/98 (2) «Специфические требования к лабораториям, ведущим подготовку к аккредитации деятельности в сфере диагностики вредных организмов растений». OEPP/EPPO Bulletin. – 2014. – V 44 (2). – P. 117-147. Стандарт ISO/IEC 17025 «Общие требования к компетенции исследовательских и калибровочных лабораторий». – 2006. СТО ВНИИКР 4.001-2010 Возбудитель ожога плодовых деревьев Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Методы выявления и идентификации. – 2010. Bereswill S. Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis / Bereswill S., Pahl A., Bellemann P., Zeller W. & Geider K. // Applied and Environmental Microbiology. – 1992. – V. 58. – P. 3522-3526. Gottsberger R. A. Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting chromosomal DNA of Erwinia amylovora / Gottsberger R. A. // Letters in Applied Microbiology. – 2010. – V. 51. – P. 285-292. Kim W. S. Molecular detection and differentiation of Erwinia pyrifoliae and host range analysis of the Asian pear pathogen / Kim W. S., Jock S. // The American Phytopathological Society. – 2001. – P. 1183-1188. Llop P. Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material / Llop P., Bonaterra A., Penalver J. & Lopez M. M. // Applied and Environmental Microbiology. – 2000. – V 66, – P. 2071-2078. Lopez M. M. Erwinia piriflorinigrans sp. nov., a novel pathogen that causes necrosis of pear blossoms / Lopez M. M., Rosellу M., Llop P., Ferrer S., Christen R., Gardan L. // International journal syst. Evol. Microbiol. – 2011. – V. 61 (Pt 3). – P. 561-567. Matsuura T. Erwinia uzenensis sp. nov., a novel pathogen that affects European pear trees (Pyrus communis L.) / Matsuura T., Mizuno A., Tsukamoto T., Shimizu Y., Saito N., Sato S., Kikuchi S., Uzuki T., Azegami K., Sawada H. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2012. – V. 62. – P. 1799-1803. Obradovic D. Detection of Erwinia amylovora by novel chromosomal polymerase chain reaction primers / Obradovic D., Balaz J. & Kevresan S. // Mikrobiologiia. – 2007. – V. 76. – P. 844-852. Petter rvey on the use of tests mentioned in EPPO Diagnostic protocols / Petter F. & Suffert M. // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. – 2010. – V. 40. – P. 5-22. Pirc M. Improved fire blight diagnostics using quantitative real-time PCR detection of Erwinia amylovora chromosomal DNA / Pirc M., Ravnikar M., Tomlinson J. & Dreo T. // Plant Pathology. – 2009. – V. 58. – P. 872-881. PM 7/20 (2) Erwinia amylovora. OEPP/EPPO Bulletin. – 2013. – V. 43 (1). – P. 21-45. Stoger A. A rapid and sensitive method for direct detection of Erwinia amylovora in symptomatic and asymptomatic plant tissues by polymerase chain reaction / Stoger A., Schaffer J. & Ruppitsch W. // Journal of Phytopathology. – 2006. – V. 154. – P. 469-473. Taylor R. K. Detection of Erwinia amylovora in plant material using novel polymerase chain reaction (PCR) primers / Taylor R. K., Guilford P., Clark R. G., Hal C. N. & Forster R. L.S. // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. – 2001. – V. 29. – P. 35-43.

Приложение 1

Информация о штаммах, использованных

для определения аналитической специфичности

№ п/п	Штамм, №	Вид бактерии	Происхождение	Результат
1	0001	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 542/1-и, R489	–
2	0002	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 542/1-и, R490	–
3	0003	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 638-и, 1п	–
4	0004	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 590-и, MR14	–
5	0005	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 579-и, MR18	–
6	0006	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 577-и, MR19	–
7	0007	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 588-и, MR20	–
8	0008	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 662-и, 3п	–
9	0009	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 662-и, 4п	–
10	0010	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 662-и, 5п	–
11	0011	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 662-и, 5п	–
12	0012	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 649-и	–
13	0013	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет	–
14	0014	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 1418/11-и, Rф661	–
15	0015	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 940-и, R656	–
16	0016	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 943-и, R657	–
17	0017	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 938-и, R653	–
18	0018	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 949-и, R663	–
19	0019	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, R652	–
20	0020	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 854-и, R622	–
21	0021	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Республика Индия, 5084 С-Петербургская МВЛ	–
22	0022	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Республика Индия, 5609 С-Петербургская МВЛ	–
23	0023	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Республика Индия, 6986 С-Петербургская МВЛ	–
24	0024	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Республика Индия, 7088 С-Петербургская МВЛ	–
25	0025	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 1045-и, МR622	–
26	0026	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, МR42	–
27	0027	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 1655/11-и, Rф866	–
28	0029	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, 11-и, Rф	–
29	0030	Ralstonia solanacearum, филотип 1	КНР, 57п, Иркутский филиал	–
30	0031	Ralstonia solanacearum, филотип 1	КНР, 60п, Иркутский филиал	–
31	0032	Ralstonia solanacearum, филотип 1	КНР, 61п, Иркутский филиал	–
32	0033	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
33	0034	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
34	0035	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
35	0036	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
36	0037	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
37	0038	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Московская область, Озерский р-н,	–
38	0039	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Нами получен из NCPPB, FERA (Йорк, Великобритания). Перу, 1970	–
39	0040	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Нами получен из NCPPB, FERA (Йорк, Великобритания). Австралия, 1970	–
40	0041	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Hungary, Domaszek, isolated 11/1999, Nemeth J.	–
41	0042	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Hungary, Domaszek, 11/1999, Kovacs N. A.	–
42	0043	Ochrobactrum sp.	Самарская обл., Волжский р-н, трасса Самара – Волгоград, поворот на Новокуйбышевск, заброшенные дачи у дороги. МЕ 958-2, 811-о	–
43	0044	Erwinia billingiae (культура изначально определена как Erwinia amylovora)	Воронежская обл., г. Воронеж, , кв. 9, 1985, 10 га 49п (№ 87)	–
44	0045	Curobacterium flaccumfaciens pv. flacumfaciens	Тамбовская обл., г. Уварово	–
45	0046	Pseudomonas congelans (штамм изначально определен как Pseudomonas syringae pv. syringae)	AOBC PPSCD, Печ, Венгрия, Kovacs N. A., Hungary, 1976	–
46	0047	Enterbacter amnigenus	Калининградская обл., г. Светлый (территория теплопункта, рядом с судоходным каналом) 213-о	–
47	0048	Ochrobactrum anthropi	Саратовская обл., г. Хвалынск, КПХ «Садов», МЕ 972, 812-о	–
48	0049	Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis	Московская область, Дмитровский р-н	–
49	0050	Xilophilus ampelinus	Нами получен из LSV Франция. France 2004	–
50	0051	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га	+
51	0052	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га	+
52	0053	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, опытный интенсивный сад, 5,5 га	+
53	0054	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, территория элеватора рядом с карантинным пунктом	+
54	0055	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционно-производственный сад, 13 га	+
55	0056	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционно-производственный сад, 10 га	+
56	0057	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционно-производственный сад, 10 га	+
57	0058	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, поросль по краю бывшего опытного интенсивного сада	+
58	0059	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИС им. Мичурина, поросль по краю бывшего опытного интенсивного сада	+
59	0060	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, молодой сад, 7 га	+
60	0061	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционный сад, 6 га	+
61	0062	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск, ВНИИГ и СПР им. Мичурина, коллекционный сад, ряд 5, дерево 12, 6 га	+
62	0063	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск	+
63	0064	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск	+
64	0065	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск	+
65	0066	Erwinia amylovora	Тамбовская обл., г. Мичуринск	+
66	0067	Erwinia amylovora	Воронежская обл., Острогожский р-н, лесополоса за территорией -питомник»	+
67	0068	Erwinia amylovora	Воронежская обл., Аннинский р-н, кв. 1, 1999 г., 4 га	+
68	0069	Erwinia amylovora	Воронежская обл., Новоусманский р-н, ТНВ «Маликов и К», кв. 79, 1973 г.	+
69	0070	Erwinia amylovora	Воронежская обл.,	+
70	0071	Erwinia amylovora	Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 49	+
71	0072	Erwinia amylovora	Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 28а	+
72	0073	Artrobacter cаstelli Штамм изначально определен как вид Cmm	-	–
73	0074	Erwinia amylovora	Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 28	+
74	0075	Erwinia amylovora	Воронежская обл., Семилукский р-н, СНТ «Росинка», участок № 000, 0,15 га, 1990 год посадки	+
75	0076	Erwinia amylovora	Воронежская обл., г. Воронеж, ул. Шишкова, напротив д. 47, 0,5 га	+
76	0077	Erwinia amylovora	Саратовская обл., Хвалынский р-н, г. Хвалынск, дорога на Черемшаны, сад яблони	+
77	0078	Erwinia tasmaniensis	-	–
78	0079	Erwinia amylovora	Саратовская обл., Хвалынский р-н, г. Хвалынск, гора Богданиха	+
79	0080	Erwinia amylovora	Самарская обл., Сергиевский р-н	+
80	0081	Erwinia amylovora	Самарская обл., Приволжский р-н, , кв. 7, 2012 г.	+
81	0082	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 7, 2012 г.	+
82	0083	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 31, 2012 г.	+
83	0084	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 13, 2012 г.	+
84	0085	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 15, 2012 г.	+
85	0086	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 15, 2012 г.	+
86	0087	Erwinia amylovora	Самарская обл. Приволжский р-н, , кв. 15, 2012 г.	+
87	0088	Erwinia amylovora	Самарская обл., Сызранский р-н, , кв. 94, 1982 г., 10,7 га	+
88	0089	Erwinia amylovora	Самарская обл., Сызранский р-н, , кв. 97, 1987 г, 10,7 га	+
89	0090	Erwinia amylovora	Самарская обл., Сызранский р-н, , кв. 95, 1981 г, 10,7 га	+
90	0091	Erwinia amylovora	Самарская обл., Сызранский р-н	+
91	0092	Acidovorax	США	–
92	0093	Acidovorax	США	–
93	0094	Acidovorax	США	–
94	0095	Erwinia amylovora	Липецкая обл., СНТ «Заря 2», массив 1, линия 6	+
95	0096	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
96	0097	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
97	0098	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
98	0099	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 9, 10,5 га	+
99	0100	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
100	0101	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
101	0102	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Тербунский р-н, кв. 1, 10,5 га	+
102	0103	Erwinia amylovora	Воронежская обл., Острогожский р-н, лесополоса за территорией -питомник»	+
103	0104	Ralstonia solanacearum, раса 3, bv. 2	Арабская Республика Египет, R 434/305-и	–
104	0105	Erwinia amilovora	Калининградская обл.	+
105	0106	Erwinia amilovora	Калининградская обл.	+
106	0107	Erwinia amilovora	Калининградская обл.	+
107	0108	Erwinia amylovora	Калининградская обл., Багратионовский р-н, вдоль ж/д Мамоново – Польша	+
108	0109	Erwinia piriflorinigrans	-	–
109	0110	Erwinia amylovora	Калининградская обл., г. Балтийск, Балтийская коса	+
110	0111	Erwinia amylovora	Калининградская обл., Нестеровский р-н, пос. Пригородное, сад возле мехдвора (зернотока)	+
111	0112	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
112	0113	Erwinia piriflorinigrans	-	–
113	0114	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
114	0115	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
115	0116	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
116	0117	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
117	0118	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
118	0119	Erwinia amylovora	Калининградская обл.	+
119	0120	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Нами получен из AOBC PPSCD, Печ, Венгрия	–
120	0121	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
121	0122	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
122	0123	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
123	0124	Xilophilus ampelinus	Итальянская Республика, сорт Шардоне	–
124	0125	Xilophilus ampelinus	Итальянская Республика, сорт Каберне Совиньон	–
125	0126	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
126	0127	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
127	0128	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
128	0129	Erwinia amylovora	Ставропольский край
129	0130	Erwinia amylovora	Ставропольский край	+
130	0131	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, R786/13	+
131	0132	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, R786/13	–
132	0133	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, R786/13	–
133	0134	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, R786/13	–
134	0135	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, R786/13	–
135	0136	Ralstonia solanacearum	КНР	–
136	0137	Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus	Московская область	–
137	0138	Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus	Московская область, R77/80-о	–
138	0139	Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus	РФ, Московская обл., Раменский р-н, д. Заворово, R40, Н. В.	–
139	0140	Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus	Клубни картофеля с. Романо	–
140	0141	Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum	Типовой штамм	–
141	0142	Pectobacterium atrosepticum	Великобритания, типовой штамм	–
142	0143	Pectobacterium atrosepticum	-	–
143	0144	Diсkeya sp.	-	–
144	0145	Diсkeya sp.	-	–
145	0146	Diсkeya sp.	-	–
146	0147	Xanthomonas fragariae	NCPPB 1469 FERA (Йорк, Великобритания)	–
147	0148	Xanthomonas campestris pv. raphani	NCPPB 1946 FERA (Йорк, Великобритания)	–
148	0149	Xanthomonas arboricola pv. pruni	AOBC PPSCD, г. Печ, Венгрия	–
149	0150	Erwinia amylovora	Белгородская обл., Прохоровский р-н, с. Редьковка	+
150	0151	Erwinia amylovora	Пензенская обл., Тамаринский р-н.	+
151	0152	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки,	+
152	0153	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки,	+
153	0154	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н, с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки,	+
154	0155	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н., с-з им. Льва Толстого, ул. Черемушки,	+
155	0156	Erwinia amylovora	Кабардино-Балкария, Баксанский р-н	+
156	0157	Erwinia amylovora	Кабардино-Балкария, с. Кенже,	+
157	0158	Erwinia amylovora	Кабардино-Балкария, Чегемский р-н, с-з Лечинкай, старый сад груши с посадкой 8 га	+
158	0159	Erwinia amylovora	Кабардино-Балкария	+
159	0160	Erwinia amylovora	Кабардино-Балкария	+
160	0161	Erwinia amylovora	Республика Молдова Страшенский р-н, промышленный сад, 105,5 га	+
161	0162	Erwinia amylovora	Республика Молдова Страшенский р-н, промышленный сад, 105,5 га	+
162	0163	Erwinia amylovora	Карачаево-Черкесская Республика, Малокарачаевский р-н, п. Красный, старый сад груши конного завода	+
163	0164	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, кв. 7, ряд 13	+
164	0165	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Волгоград, дендрарий ВНИИАЛМИ	+
165	0166	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, кв. 7, ряд 12	+
166	0167	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., 3	+
167	0168	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Волгоград, дендрарий ВНИИАЛМИ	+
168	0169	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, сад айвы	+
169	0170	Erwinia amylovora	Волгоградская обл., г. Краснослободск, ГНУ ВОС ВНИИР им. Вавилова, сад айвы	+
170	0171	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, Карельский филиал	–
171	0172	Erwinia amylovora	IVIA, Валенсия, Испания, нами получен из Bielefeld, France	+
172	0173	Erwinia amylovora	Республика Польша, Новый Двор, Опытное цветоводческое предприятие Институт садоводства и цветоводства	+
173	0174	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет	–
174	0175	Erwinia amylovora	Республика Польша, г. Пасечно, питомник декоративных растений «Эмиль Хома»	+
175	0176	Erwinia amylovora	Республика Польша, г. Пасечно «Кордус»	+
176	0177	Erwinia amylovora	Республика Польша, г. Пасечно «Кордус»	+
177	0178	Erwinia amylovora	Республика Польша, г. Пасечно «Кордус»	+
178	0179	Erwinia amylovora	Республика Польша, Wojewodztwo Mazowieckie, питомник «Грабчевски»	+
179	0180	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алматинская обл., Енбекшиказахский р-н, Байтерекский с/о, крестьянское х-во «Жарык», промышленный сад, 15 га	+
180	0181	Rahnella sp.	Нидерланды	–
181	0182	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
182	0183	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
183	0184	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
184	0185	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
185	0186	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
186	0187	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
187	0188	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
188	0189	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
189	0190	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
190	0191	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н, с/х им. Л. Толстого, ул. Механизаторов, ,	+
191	0192	Erwinia amylovora	Республика Киргизия	+
192	0193	Erwinia amylovora	Липецкая обл., Лев-Толстовский р-н, с/х им. Л. Толстого, ул. Механизаторов, ,	+
193	0194	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская область	+
194	0195	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская область	+
195	0196	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская область	+
196	0197	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская обл.	+
197	0198	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская обл.	+
198	0199	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская обл.	+
199	0200	Erwinia amylovora	Республика Казахстан, Алма-Атинская обл.	+
200	0201	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Краснодарский край	–
201	0202	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Краснодарский край	–
202	0203	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Краснодарский край	–
203	0204	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Нами получен из Германии	–
204	0205	Pantoea stewartii subsp. stewartii	Нами получен из Германии	–
205	0206	Pantoea stewartii subsp. stewartii	ЮАР, ФГБУ «Краснодарская МВЛ»	_
206	0207	Pantoea stewartii subsp. stewartii	ЮАР, ФГБУ «Краснодарская МВЛ»	_
207	0208	Erwinia amylovora	5Д, территория Троицкого женского монастыря	+
208	0209	Ralstonia solanacearum	Народная Республика Бангладеш, ФГБУ «Ленинградская МВЛ»	_
209	0210	Erwinia amylovora	5Д, территория Троицкого женского монастыря	+
210	0211	Ralstonia solanacearum	Арабская Республика Египет, ФГБУ «Ленинградская МВЛ»	_
211	0212	Erwinia amylovora	5Д, территория Троицкого женского монастыря	+
212	0213	Erwinia amylovora	Пензенская обл., р. п. Тамала, ул. Пацаева, д. 23	+
213	0214	Erwinia amylovora	Пензенская обл., р. п. Тамала, ул. 60 лет Октября	+
214	0215	Erwinia amylovora	Пензенская обл., р. п. Тамала, пер. Березовый, д. 2	+
215	0216	Erwinia amylovora	5Д, территория Троицкого женского монастыря	+
216	0217	ДНК Erwinia pyrifoliae	Проект Phytfire (EUPHRESCO II)	_
217	0218	ДНК Erwinia uzenensis	Проект Phytfire (EUPHRESCO II)	_

Приложение 2

Тесты, не требующие дополнительной оценки повторяемости

и воспроизводимости, касающиеся возбудителя бактериального

ожога плодовых культур Erwinia amylovora

(выдержка из Стандарта ЕОКЗР PM 7/20 (2))

Бессимптомные образцы	Образцы с симптомами
Прямое выделение возбудителя (на среды CCT, King's B и Levan)	Реакция агглютинации
Обогащение DASI ИФА	Биохимические тесты
Обогащение с последующей классической ПЦР	Прямое выделение возбудителя (на среды CCT, King's B и Levan)
Обогащение с последующей классической ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992	Методы секвенирования ДНК
Обогащение с последующим ПЦР-РВ в соответствии с Gottsberger, 2010	Обогащение DASI ИФА
Обогащение с последующим ПЦР-РВ в соответствии с Pirc et al., 2009	Обогащение с последующим выделение возбудителя (на среды King's и CCT)
Обогащение с последующим выделение возбудителя (на среды King's и CCT)	Профили жирных кислот
Выделение возбудителя с последующей проверкой реакции агглютинации	Сверхчувствительная реакция
Выделение возбудителя с последующим секвенированием ДНК	Реакция иммунофлуоресценции
Выделение возбудителя с последующей постановкой реакцией сверхчувствительности	Иммунохромотографический анализ
Выделение возбудителя с последующей постановкой реакцией иммунофлуоресценции	Nested-ПЦР в соответствии с Llop et al., 2000
Выделение возбудителя с последующей постановкой теста на патогенность	Тест на патогенность
ПЦР в соответствии с Bereswill et al., 1992
ПЦР в соответствии с оптимизированным протоколом Obradovic et al., 2007
ПЦР в соответствии с Stoger et al., 2006
ПЦР в соответствии с Taylor et al., 2001
ПЦР-РВ в соответствии с Gottsberger, 2010
ПЦР-РВ в соответствии с Pirc et al., 2009

1 Состав фосфатно-солевого буфера (PBS): Na2HPO4 х 12Н2О 2,9 г/л, КH2PO4 х 2Н2О 0,2 г/л, NaCl 8,0 г/л, KCl 0,2 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7,2.

2 Состав питательной среды Levan: дрожжевой экстракт 2,0 г/л, пептон бактериологический 2,0 г/л, сахароза 50 г/л, NaCl 5,0 г/л, агар бактериологический 15,0 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7-7,2.

3 Состав фосфатного буфера (PB): Na2HPO4 4,26 г/л, КH2PO4 2,72 г/л, дистиллированная вода 1 л, рН 7,0.