Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со STЦGER ET AL., 2006) (стр. 1 )

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ

И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ

Федеральное государственное бюджетное учреждение

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ»

(ФГБУ «ВНИИКР»)

УТВЕРЖДАЮ Директор ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») _______________ «___» __________________ 2014 г.

Валидация метода Классической ПЦР

для выявления возбудителя ожога плодовых КУльтур

Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al.

в растительном экстракте

(В СООТВЕТСТВИИ СО STЦGER ET AL., 2006)

(отчет)

Москва - 2014 г.

Отчет по теме «Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006)» подготовлен младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов , заведующим лабораторией бактериологии и молекулярных методов ФГБУ «ВНИИКР» к. б.н. , младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов , младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов , младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов , младшим научным сотрудником лаборатории бактериологии и молекулярных методов .

Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ФГБУ «ВНИИКР» (протокол № ____ от «______» _________ 2014 г.).

Редактор – .

Оглавление

Введение………………………………………………………………………..	4
Материалы и методы исследований……………………………………	7
Растительный материал……………………………………………..... Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia amylovora и инокуляция растительных экстрактов…..…….………. Получение стандартной базовой суспензии……………………. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности.….. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности для определения селективности……………..……………………….……. Изоляты и штаммы бактерий…………..……………………………. Выделение ДНК из растительных экстрактов…………...…………. Постановка классической ПЦР……………………….....................…..	7 7 7 8 9 10 11 11
Результаты тестирований и обсуждение……………………………..…. 2.1. Определение стандартной базовой суспензии культуры  E. amylovora……………………………………………..………………….. 2.2. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности………... 2.3. Аналитическая чувствительность…………..……………...………….. 2.4. Аналитическая специфичность…………………………...…………… 2.5. Селективность……………………………………………..……………. 2.6. Повторяемость…………………………………...……………………… 2.7. Воспроизводимость…………………………………………..………… Выводы………………………………………………………...………………. Заключение………………………………………………………….…………. Список литературы……………………………………………….…………… Приложение 1…………………………………………………..……………... Приложение 2………………………………………………..………………...	14 14 14 15 16 21 23 24 26 27 28 30 44

Введение

Разработка систем управления качеством (также называемых системами управления или системами качества) и аккредитация на соответствие Стандарту ISO/IEC 17025 стали проблемными вопросами для многих лабораторий в регионе ЕОКЗР.

Традиционно аккредитация лабораторий основывается на фиксированной области аккредитации, что четко и однозначно определяет серию тестов, которые она охватывает (например, иммунофлуоресцентный тест на выявление Ralstonia solanacearum в клубнях картофеля). Однако в современных условиях, когда активно развиваются новые направления в диагностике, а также могут меняться запросы клиентов к конкретной лаборатории, фиксированная область аккредитации не позволяет с легкостью добавлять новые или модифицированные тесты в область деятельности лаборатории.

Вследствие этого была разработана концепция гибкой области аккредитации. Гибкая аккредитация позволяет лаборатории выполнять определенные тесты и сообщать о результатах как об аккредитованных даже в том случае, если эти тесты четко не указаны в области деятельности лаборатории («Требования к гибкой аккредитации» EA-2/15, 2008). Опыт фитопатологических лабораторий показывает, что при гибкой области аккредитации лаборатория несет больше ответственности за подтверждение надежности и достоверности (валидности) тестов, их соответствия обстоятельствам использования и подтверждение того, что они проводятся компетентно и единообразно.

Аккредитованная лаборатория должна использовать только те тесты, которые прошли валидацию (признаны надежными и достоверными). Возможно использование тестов, валидированных ранее другими лабораториями. В противном случае тесты должны пройти процедуру валидации в лаборатории, которая намеревается использовать данный тест. Валидация проводится для предоставления объективных данных о том, что данный тест соответствует условиям использования. В сфере диагностики вредных организмов растений тест должен быть подходящим для проведения рутинной диагностики.

Тест считается полностью валидным, когда предоставляются данные о следующих рабочих критериях: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, воспроизводимость и повторяемость. В зависимости от области применения также может возникнуть необходимость в определении его селективности. Тесты, прошедшие валидацию и имеющие предоставленные рабочие критерии, считаются «стандартными тестами». Не все тесты, включенные в диагностические протоколы ЕОКЗР, являются валидированными; опрос, проведенный в 2008 и 2013 годах на предмет их использования (Petter & Suffert, 2010) показал, что тесты, представленные в Приложении 2, широко используются. Следовательно, эксперты-участники группы ЕОКЗР по диагностике считают, что эти тесты показывают соответствующий уровень повторяемости и воспроизводимости. Лаборатории, использующие данные тесты, должны по крайней мере получить данные по проверке аналитической чувствительности и аналитической специфичности.

Валидация метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006) была проведена согласно схеме, описанной в Стандарте ЕОКЗР PM 7/98 (2) (рис. 1).

В данном отчете приводятся результаты исследований по валидации метода классической ПЦР для выявления возбудителя ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. в растительном экстракте (в соответствии со Stцger et al., 2006), c использованием различных коммерческих реагентов и оборудования, имеющихся в лаборатории бактериологии и молекулярных методов Испытательного экспертного центра (ИЭЦ) ФГБУ «ВНИИКР».

Материалы и методы исследований
Растительный материал

Для валидации метода классической ПЦР с использованием диагностической системы к возбудителю ожога плодовых культур Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. использовали смесь замороженных при -20 °С экстрактов вегетативных частей (ветвей) растений сем. Розовые (Rosбceae), свободных от возбудителя и искусственно инокулированных культурой Erwinia amylovora. Растительные экстракты получены согласно диагностическому протоколу ЕОКЗР PM 7/20 (2) (OEPP/EPPO Bulletin, 2013) и «Методическим рекомендациям по выявлению и идентификации Erwinia amylovora (СТО ВНИИКР 4.001-2010).

Получение стандартной базовой суспензии культуры Erwinia amylovora и инокуляция растительных экстрактов
Получение стандартной базовой суспензии

Для получения стандартной базовой суспензии с концентрацией 107 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл петлю культуры возбудителя суспензировали в 1000 мкл 0,01 М стерильного фосфатно-солевого буфера1 (PBS) и готовили серию десятикратных разведений, последовательно перенося 100 мкл предыдущего разведения к 900 мкл PBS последующего. Далее проводили посев 100 мкл суспензии из каждого разведения в чашки Петри на питательную среду Levan2 для подсчета числа КОЕ. В результате получали суспензию с различным содержанием КОЕ патогена.

Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности

В соответствии со Стандартом ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения аналитической чувствительности используют 3 серии (повторности) экстрактов с уровнем зараженности 101-106 клеток целевого организма на миллилитр.

Образцы с различным уровнем зараженности готовили по следующей схеме:

Готовили экстракт вегетативных частей в количестве, необходимом для оценки четырех методов выделения ДНК, смешивая протестированные ранее экстракты, хранившиеся при -20 °С. Экстракты были приготовлены согласно СТО ВНИИКР 4.001-2010. Для этого растительный материал встряхивали в 30 мл фосфатного3 буфера в течение 90 минут. Фильтровали через бумажный фильтр и центрифугировали 10 мин на 8000 об/мин при 5 °С. Удалили супернатант и ресуспендировали осадок каждого образца в 1 мл фосфатно-солевого буфера. Приготовили 7 10-кратных разведений базовой суспензии с концентрацией 106-100 КОЕ/мл, объемом 1000 мкл каждый, в соответствии с п. 1.2.1. В новые пробирки переносили 900 мкл растительного экстракта и добавляли 100 мкл бактериальной суспензии начиная с базовой, с концентрацией 107 КОЕ/мл и далее последовательно, заканчивая концентрацией 100 (табл. 2). Всего было приготовлено 3 серии (повторности) образцов из каждого из 10-кратных разведений. Далее каждый образец был разделен на субобразцы, объем которых составил 200 мкл. В качестве отрицательного контроля использовали чистый экстракт, свободный от возбудителя ожога плодовых. Оставшуюся базовую суспензию и 10-кратные разведения поместили в морозильную камеру при -20 оС для дальнейших испытаний.

1.2.3. Подготовка экстрактов с различным уровнем зараженности для определения селективности

Согласно Стандарту ЕОКЗР РМ 7/98 (2), для определения селективности необходимо оценить влияние природного субстрата, что применительно к бактериям означает оценку влияния экстрактов различных растений-хозяев и различных сортов растений-хозяев на качество исследований. Определение селективности осуществляется путем добавления различных концентраций бактериальной культуры в экстракты вегетативных частей здоровых растений (ветви) различных сортов сем. Розовые (Rosбceae).