Практические задания по медицинской микробиологии, вирусологии (стр. 5 )

Вопросы для  обсуждения:

Какие свойства нуклеиновых кислот положены в основу молекулярно-генетических методов исследования? Чем обусловлена геноидентификация видов организмов? Сущность метода молекулярной гибридизации (МГ) нуклеиновых кислот. «Молекулярный зонд», его назначение. Варианты постановки МГ нуклеиновых кислот и результатов ее учета. Отличия полимеразной цепной реакции (ПЦР) от метода МГ нуклеиновых кислот. Ингредиенты, необходимые для постановки ПЦР. Функция «праймеров». Этапы цикла ПЦР. Методы регистрации ПЦР. Рестрикционный анализ (сиквенс-анализ), его применение. Риботипирование, его практическое использование. Основы генной инженерии и биотехнологии.

Практические  задания:

Изучить схемы постановки:

а) метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот;

б) полимеразной цепной реакции.

Учесть результаты ПЦР на агарозном геле после разделения продуктов амплификации ДНК микроорганизмов методом электрофореза и окрашивания этидием бромида. Выявить геномные фрагменты и сопоставить их с контрольным образцом. Дорисовать схему постановки метода молекулярной гибридизации.

Двуцепочечная ДНК-мишень,
	Денатурация ДНК
Присоединение ДНК-зонда (возможные метки: изотоп, ФИТЦ, фермент)
Разделение одно - и двуцепочечных фрагментов ДНК
Детекция двуцепочечных ДНК

Рис. 1. Схема постановки метода молекулярной гибридизации.

Дорисовать схему постановки метода молекулярной ПЦР.

Ингредиенты для постановки ПЦР: праймеры, азотистые основания, термостабильная ДНК-полимераза.

Двуцепочная ДНК-мишень
	Праймеры, комплементарные консервативным последовательностям нуклеиновых кислот
1-й цикл
	1-й этап. Денатурация ДНК при 90-950С
2-й этап. Отжиг праймеров при 50-650С
	3-й этап. Достраивание комплементарнй цепи ДНК при участии ДНК-полимеразы при 720С

Повторные циклы приводят к накоплению последовательности ДНК, ограниченной праймерами.

Детекция двуцепочечных ДНК.

Рис. 2. Схема постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) 

Подпись преподавателя ________________ 

Дата__________________

Занятие  №12

Тема:  Антимикробные препараты. Антибиотики. Врожденная и приобретенная резистентность бактерий к антибиотикам. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам. Антимикотики. Антивирусные препараты.

Вопросы для обсуждения:

Определение понятия «антибиотики». Избирательная активность антибактериальных препаратов. Классификация антибиотиков (происхождение, химический состав, спектр действия, механизм действия). Основные группы антибиотиков и механизмы их противомикробного действия. Механизмы устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Генетические основы резистентности микроорганизмов к антибиотикам. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (метод дисков, метод серийных разведений, геноиндикация – ПЦР). Применение автоматизированных анализаторов для определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Измерение эффективности действия антибиотиков: минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация (МИК, МПК). Минимальная бактерицидная концентрация (МБК). Пути преодоления устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Лечебные химиотерапевтические противогрибковые препараты. Противовирусные химиотерапевтические препараты (общие понятия). Классификация противовирусных химиопрепаратов в зависимости от механизма действия, мишени для действия препаратов:

ингибиторы депротеинизации (ремантадин); ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (рибавирин); ингибиторы обратной транскриптазы ретровирусов (азидотимидин, зидовудин); ингибиторы вирусных протеаз (саквинавир).

Практические задания:

Определить чувствительность S. aureus к антибиотикам методом стандартных дисков и оценить полученные результаты.

  __________________________________

  __________________________________

  __________________________________

  __________________________________

  __________________________________

Таблица 1.

Результаты определения чувствительности S. aureus к антибиотикам методом стандартных дисков

Антибиотик	Зона задержки роста в диаметре (мм)	Оценка чувствительности

Критерии* оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Зона задержки роста в диаметре.

> 25 мм  -  высокая чувствительность к антибиотику

15-20 мм  –  умеренная чувствительность  – “  -

10-15 мм  –  низкая чувствительность  – “ -

< 10 мм  –  нечувствительность или устойчивость к антибиотику.

* - смотри приложение в конце протокола

Выявить чувствительность S. aureus к стрептомицину методом серийных разведений в МПБ. Определить минимальную ингибирующую концентрацию и минимальную бактерицидную концентрацию стрептомицина.

1) Наличие роста S. аureus (помутнение среды) выявлено в пробирках с МПБ, содержащих следующие концентрации антибиотика ____________________

2) Отсутствие роста S. аureus (прозрачный МПБ) отмечается в пробирках с МПБ, содержащих следующие концентрации антибиотика ________________

Вывод: минимальная, ингибирующая рост St. aureus концентрация стрептомицина составляет  ______________мкг/мл.

3) При высеве на МПА из пробирок  с отсутствием роста S. аureus получены следующие результаты: _________________________________

_______________________________________________________________

 

Вывод: минимальная бактерицидная  концентрация стрептомицина  в  отношении S. аureus составляет  ______________мкг/мл.

Указать основные мишени бактериальной клетки и действующие на них антибиотики. 

  Клеточная

1  стенка  2
5   6		ЦПМ 3,4
7
№	Наименование мишени	Механизм действия антибиотика
1
2
3
4
5
6
7

Изучить противогрибковые препараты (полиеновые антибиотики, имидазолы и др.) и указать механизм их действия.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Подпись преподавателя ________________

Приложение 1:

*Критерии оценки чувствительности стафилококков к антибактериальным препаратам

Антибактериальные препараты, группа	Диаметры зон ингибиции ( мм)
R	I	S
Беталактамы бензилпенициллин	< 28	-	> 29
Макролиды эритромицин	< 13	14-22	> 23
Аминогликозиды амикацин	< 14	15-16	> 17
канамицин	< 13	14-17	> 18
Линкозамиды линкомицин	< 17	18-20	> 21
Гликопептиды ванкомицин	-	-	> 15
Тетрациклины тетрацинклин	< 14	15-18	> 19
Хинолоны ципрофлоксацин	< 15	16-20	> 21
Другие препараты рифампин	< 16	17-19	> 20

Примечание: R - резистентные штаммы,  I -  умеренно чувствительные, S – чувствительные