Методические указания по биотестированию природных и сточных вод (стр. 13 )

│  │и составляют +-15-30%  │  │сична  │

├─────┼─────────────────────────────────┼─────────────┼─────────────────┤

│  │Отклонения от Контроля достоверны│ до 7 суток  │Вода  средне-ток-│

│  │и составляют +-30-50%  │  │сична  │

├─────┼─────────────────────────────────┼─────────────┼─────────────────┤

│ 4.  │Отклонения от Контроля достоверны│ до 4 суток  │Вода  высоко-ток-│

│  │и составляют +-50-80%  │  │сична  │

├─────┼─────────────────────────────────┼─────────────┼─────────────────┤

│ 5.  │Отклонения от Контроля достоверны│ до 1 суток  │Вода гипертоксич-│

│  │и составляют +-50-80% или более  │  │на  │

└─────┴─────────────────────────────────┴─────────────┴─────────────────┘

4.Биотестирование на инфузориях

В основу метода положен один из вариантов определения острой токсичности воды по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum [11].

Используется:

- для определения токсичности сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения, что позволяет проводить технологическую корректировку режима подготовки и очистки сточных вод;

- для определения токсичности локальных потоков сточных вод, что позволяет выяснять их взаимодействие, определять вклад каждого потока в токсичность сточных вод отдельного предприятия, суммарную токсичность сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения;

- для определения токсичности водных растворов отдельных веществ и их смеси.

4.1. Принцип методики

Методика определения острой летальной токсичности сточной воды по выживаемости инфузорий основана на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в тестируемой воде. Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвиживание 50% и более особей в течение 1 часа в тестируемой воде по сравнению с их исходным количеством.

4.2. Тестовый организм

В качестве тест-объекта используют лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg.

Paramecium caudatum - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретенообразной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой). Передний конец закруглен, задний заострен. Реснички одинаковой длины, равномерно покрывают все тело парамеции, лишь на заднем конце они несколько длиннее остальных. Питание осуществляется через рот, расположенный на дне околоротовой впадины (перистом). Перистом расположен близко к центру тела. Под оболочкой по всей поверхности тела имеются многочисленные трихоцисты, выполняющие защитную функцию.

Ядерный аппарат представлен двумя видами ядер: макронуклеус один, имеет бобовидную форму, лежит в центре тела. В его выемке находится шаровидный микронуклеус. Две пульсирующие вакуоли, регулирующие водный баланс, расположены в разных концах тела. Количество пищеварительных вакуолей непостоянно и зависит от количества пищи.

Бесполое размножение осуществляется поперечным делением на две дочерние особи. Половое размножение происходит по типу коньюгации, т. е. временного соединения двух особей для обмена частями ядерного аппарата.

Питаются парамеции бактериями, мелкими жгутиконосцами, водорослями. Относятся к эвриоксибионтам, т. е. могут встречаться в среде с широким колебанием содержания растворенного в воде кислорода. Оптимальная температура 24-28°С, оптимальная концентрация солей во внешней среде составляет 600-1400 мг/л. Для инфузорий характерно быстрое размножение при наступлении благоприятных условий (2-4 деления в сутки) и такое же быстрое исчезновение при обратном явлении.

Paramecium caudatum - массовый вид в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. В сточной воде является часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб. Простейшие, в том числе ресничные инфузории, составляют основную часть микрофауны активного ила. Они участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способствуя тем самым повышению эффективности очистки.

4.3. Выделение и культивирование

4.3.1. Выделение из активного ила.

Наиболее подвижную и крупную особь отлавливают из пробы активного ила очистных сооружений и переносят в микроаквариум со стерильной водопроводной водой. Путем последовательного переноса этой особи из лунки в лунку добиваются отделения ее от других простейших и цист. Затем помещают отмытую инфузорию в пробирку со средой культивирования. Через 7-8 суток из полученной таким образом монокультуры одну наиболее крупную и подвижную особь вновь переносят в свежую среду. Спустя 8-10 суток культуру можно использовать для определения токсичности.

4.3.2. Культивирование инфузорий на молоке.

Культуру парамеций выращивают на дехлорированной водопроводной воде, которую добавляют разбавленное в 20 раз такой же водой пастеризованное молоко. Пересевают культуру инфузорий один раз в месяц (при необходимости один раз в три недели). Для этого в пробирки наливают по 10 мл дехлорированной водопроводной воды, помещают в водяную баню и выдерживают в кипящей воде в течение 15-20 минут. Затем пробирки вынимают, охлаждают их содержимое и добавляют в каждую пробирку пипеткой на 1-2 мл по 1 капле (0,02 мл) разбавленного в 20 раз молока.

Пробирки помещают на сутки в термостат при температуре 27-28°С для развития бактерий, которыми питаются парамеции. Через сутки в каждую пробирку снова добавляют по одной капле разбавленного молока. Таким образом содержимое пробирок становится питательной средой для выращивания парамеций.

Пересев клеток из старой культуры на свежую питательную среду производят следующим образом. На предметный столик стереомикроскопа помещают микроаквариум. Устанавливают такое увеличение, чтобы вся лунка микроаквариума была в поле зрения. Одну из лунок заполняют старой культурой. Четыре лунки (если культура заражена другими простейшими, то шесть лунок) заполняют на 1/3 объема дехлорированной водопроводной водой. Капиллярной пипеткой отбирают небольшое количество старой культуры и переносят в первую лунку с водопроводной водой. Пипетку тщательно промывают и, наблюдая в микроскоп, переносят клетки из первой лунки во вторую, затем из второй в третью и так далее каждый раз тщательно промывая капиллярную пипетку. Таким образом, клетки парамеций отмывают от остатков старой среды и избавляют от других простейших в случае зараженной исходной культуры. Из последней лунки чистой капиллярной пипеткой инфузорий переносят в пробирки с подготовленной свежей питательной средой, помещая в каждую пробирку по одной клетке. Пробирки с посевами ставят в термостат при температуре 27-28°С.

Каждый день инфузорий кормят молоком, разбавленным в 20 раз дехлорированной водопроводной водой, добавляя пипеткой на 1-2 мл в каждую пробирку по 1 капле разбавленного молока.

Оптимальная температура содержания культуры парамеций 24-28°С. Можно оставлять культуру при комнатной температуре. Культуру содержат в темноте, чтобы не развивались водоросли.

4.3.3. Условия транспортировки тест-объекта.

Во время транспортировки тест-объекта в пробирках последние должны быть плотно закрыты инертным материалом (например, полиэтиленовыми пробками). По окончании транспортировки герметичные пробки заменяют ватными. При транспортировке допустимы колебания температуры в пределах от 8 до 30°С. Если колебания температуры при транспортировке были незначительны и не выходили за пределы 20-28°С, а пробирки были герметично закрыты не более 4 часов, адаптацию проводить не нужно. При более длительном времени транспортировки необходима суточная адаптация культуры в пробирках под ватными пробками. Во избежание гибели монокультуры, пробирки в герметично закрытом состоянии должны находиться не более 48 часов.

4.4. Материалы и оборудование

Подсчет Paramecium caudatum производят с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9, МБС-10 или иного, обеспечивающего 8-24 кратное увеличение. Конструкция микроаквариумов из прозрачного органического стекла приведена на рис.4.1. Для разбавления и внесения одинакового количества исследуемой пробы используют стандартные стеклянные пипетки. Для внесения определенного количества особей используют капилляры (рис.4.2).