Методические указания по биотестированию природных и сточных вод (стр. 2 )

Приготовить 2 маточных раствора микроэлементов (А и Б): Для этого взвесить и затем последовательно растворить в 250 мл дистиллированной воды 0,71 г Н3ВО3, 0,45 г МnСl2 х 4Н2О, 0,055 г ZnSO4 х 7H2O - (раствор А).

Взвесить и последовательно растворить в 250 мл дистиллированной воды 4,41 мг МоО3, 5,74 мг NH4VO3 - (раствор Б).

Приготовить 1000 мл среды тамия путем последовательного приливания в 1 л мерную колбу следующих объемов маточных растворов:

KNO3 (25%-раствор) - 20 мл

КН2РО4 (12,5%-раствор) - 10 мл

MgSO4 (12,2%-раствор) - 10 мл

FeSO4 х 7H2O (1%-раствор) - 1 капля

Раствор А - 1 мл.

Раствор Б - 1 мл.

Довести объем раствора дистиллированной водой до 1 литра.

Разбавить полученную концентрированную среду тамия в 5 раз: к 100 мл концентрированной среды тамия добавить 400 мл дистиллированной воды; или к 200 мл среды тамия 800 мл дистиллированной воды, и т. д.

Засеять разбавленную в 5 раз среду тамия 5-10-дневной хлореллой (до светло-зеленого окрашивания; 200 тыс. клеток/мл).

Разлить приготовленные растворы среды тамия по колбам емкостью 1-2 литра. Обеспечить непрерывную продувку воздуха через культуру и 12-часовой цикл освещения с интенсивностью 2000-3000 люкс (температура 18-20°С).

Через 3-7 суток сгустить культуру (например, путем отстаивания в течение 2-3 суток в холодильнике для получения суспензии клеток).

Хлореллу вносят в культуру дафний ежедневно из расчета 1 мл суспензии на 1 л воды, поддерживая концентрацию клеток в среде на уровне 200 тыс. в 1 мл. Суспензию (концентрат) хлореллы можно хранить в холодильнике не более 3 недель [2], маточные растворы - до 1 месяца.

2.3. Определение устойчивости Daphnia Magna Straus к бихромату калия

Прежде всего необходимо оценить пригодность лабораторной культуры дафний для последующего биотестирования вод. Эталонным токсикантом служит бихромат калия.

Материалы

Стакан емкостью 100-250 мл (21 штука).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке). Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3 л. Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.), на 1000 мл (1 шт.).

210 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.

Подготовка опыта

Приготовить 100 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 (1000 мг/л).

Для этого 0,1 г просушенного К2Сr2О7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Расставить 21 стакан с надписями по следующей схеме:

  К1  0,25  мг/л  0,5 мг/л  0,75 мг/л  1 мг/л  2 мг/л  3 мг/л

  К2  0,25  мг/л  0,5 мг/л  0,75 мг/л  1 мг/л  2 мг/л  3 мг/л

  КЗ  0,25  мг/л  0,5 мг/л  0,75 мг/л  1 мг/л  2 мг/л  3 мг/л

Из 0,1% маточного раствора К2Сг2О7 приготовить серию растворов с концентрациями 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3 мг/л по следующей схеме: (При всех последующих разведениях используется только профильтрованная биологизированная вода (РВ) из аквариумов с водной растительностью).

а) 1 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 999 мл РВ = 1л (1 мг/л). Из 1 литра полученного раствора 300 мл разливается поровну по трем стаканам с надписью 1 мг/л.

б) Оставшиеся 700 мл раствора (1 мг/л) идут на приготовление растворов с концентрациями 0,25 и 0,5 мг/л по следующей схеме:

125 мл 1 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,25 мг/л) (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,25 мг/л),

250 мл 1 мг/л + 250 мл РВ = 500 мл (0,5 мг/л) (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,5 мг/л).

в) 1 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 499 мл РВ = 500 мл 2 мг/л (300 мл разливают по трем стаканам с надписью 2 мг/л)

г) 1,5 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 + 498,5 мл РВ = 500 мл 3 мг/л. Из 500 мл полученного раствора 300 мл разливается по трем стаканам с надписью 3 мг/л.

д) Оставшиеся 200 мл раствора (3 мг/л) идут на приготовление раствора с концентрацией 0,75 мг/л по следующей схеме:

125 мл 3 мг/л + 375 мл РВ = 500 мл (0,75 мг/л)(300 мл разливают по трем стаканам с надписью 0,75 мг/л).

е) В стаканы К1-КЗ (контроль) разливают по 300 мл биологизированной воды.

Стаканы с растворами расставить в люминостате. Произвести замеры температуры в люминостате (норма 18-22°С), рН растворов (норма 6,5-8,5), концентрации растворенного кислорода (перед началом опыта около 6 мг/л, в конце опыта - не менее 2 мг/л). Если начальная концентрация растворенного кислорода ниже 6 мг/л, то перед разливом растворов осуществляется их аэрация до достижения концентрации растворенного кислорода 7-8 мг/л. Аэрация может быть осуществлена с помощью аквариумного микрокомпрессора. Режим освещения в люминостате - 12-часовой с интенсивностью 400-600 люкс [1, 2].

Посадка рачков

Во все стаканы с растворами посадить по 10 рачков в возрасте строго 4-24 часа. Посадку производить с помощью микропипеток со съемными пластиковыми наконечниками. Концы наконечников предварительно необходимо обрезать под величину дафнии одно-двухдневки.

Эксперимент

Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят. Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%. Результаты заносят в протокол опыта (табл.2.1).

Таблица 2.1

Протокол опыта

Дата ___________ Температура, рН, концентрация О2 (в  начале  и  в  конце

опыта)___________________________________________________________________

┌──────┬──────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│Время │  Количество выживших дафний (экз.)  │

│от на-├───────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬─────────┬────────┤

│чала  │ Контроль  │0,25 мг/л│0,5 мг/л │0,75 мг/л│ 1 мг/л  │ 2 мг/л  │ 3 мг/л │

│опыта ├───────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼────────┤

│  │  _ │  _  │  _  │  _  │  _  │  _  │  _ │

│  │1  2  3  Xk│1 2 3 Хо │1 2 3 Хо │1 2 3 Хо │1 2 3 Хо │1 2 3 Хо │1 2 3 Хо│

├──────┼───────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼─────────┼────────┤

│ 24 ч │10 10 10 10│9 9 9 9  │8 9 8 8,3│6 6 6 6  │5 5 6 5,3│4 5 4 4,3│2 2 2 2 │

└──────┴───────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴─────────┴────────┘

Обработка результатов

Смертность рачков в процентах к контролю (А) рассчитывается по формуле [2]:

  _  _

  (Xk - Хо)

  А = ------------- х 100, где

  _

  Xk

  _

  Xk - среднее арифметическое количества рачков, выживших в контроле,

  _

  Хо - среднее арифметическое количества рачков, выживших в опыте.

Результаты опытов за 24 часа наносятся на график:

"График "Концентрация K2Cr2O7, мг/л""

Из графика находят ЛК50 - концентрацию вещества, вызывающую гибель 50% особей. Для бихромата калия величина ЛК50 должна лежать в диапазоне 0,9 - 2,0 мг/л. В этом случае тест-культура дафний пригодна для определения токсичности вод [1, 2].

Более подробную характеристику токсичности бихромата калия (или любого другого индивидуального химического соединения) можно получить используя специальную программу "Биостат"-ЦСИАК (тест Литчфильда-Уилкоксона в модификации Рота) [6]:

Пример (по данным таблицы 2.1): ЛК50 = 1,23596, ЛК16 = 0,37877, ЛК84 = 4,03307, S-функция (наклон кривой) = 3,26309.

  ЛК84/ЛК50 + ЛК50/ЛК16

  S = -----------------------

  2

2.4. Определение устойчивости Ceriodaphnia Affinis к бихромату калия

Материалы

Стакан емкостью 50-100 мл (28 штук).

Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке).