Методические указания по биотестированию природных и сточных вод (стр. 7 )

Посуда

Промыть в питьевой соде, сполоснуть до 20 раз водопроводной, а затем дистиллированной водой (2 раза). Просушить в шкафу, колбы закрыть ватными пробками и бумагой. Пипетки должны быть с ватной защитой.

Стерилизация: 160°С, 1,5 часа в суховоздушном шкафу (либо автоклавирование).

Подготовка культуры

В опыте использовать 5-10 суточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста. Перед посевом культуру сгущают одним из трех способов: - отстаиванием 2-3 дня, центрифугированием, фильтрованием через мембранный фильтр N 4 или фильтровальную бумагу с синей лентой. Полученная суспензия (концентрат) клеток используется для последующего посева.

Посев

Производится в большую опытную колбу емкостью 1,5 л, в случае биотестирования в колбах (по 100 мл) или в колбу емкостью 150 мл при биотестировании в пенициллиновых пузырьках (по 10 мл). Обычно требуется примерно 30 мкл суспензии на 30 мл воды.

В опытных колбах после посева должно быть около 200-300 тысяч клеток водорослей в 1 мл (не более 500 тысяч/мл) - едва заметное зеленоватое окрашивание на белом фоне.

Разлив

Из большой колбы произвести разлив культуры по колбам (3 повторности по 100 мл) или пенициллиновым пузырькам (3 повторности по 10 мл).

3.3. Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры
к бихромату калия

Подсчет производят с помощью микроскопа (например типа "Биолам") при 80-100 кратном увеличении. Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или Фукс-Розенталя. Камеру и относящееся к ней покровное стекло обезжиривают, покровным стеклом накрывают камеру и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы пипеткой наносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 квадратов по диагонали или все поле камеры в случае малой численности водорослей (при одном заполнении камеры просчитывают не менее 50 клеток). Из каждой колбы просматривают не менее трех проб. Вычисляют по формуле количество клеток водорослей в 1 мл суспензии:

  m  3

  М = ------- х 10 , где

  n x V

m - количество подсчитанных клеток; n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющий площадь маленького квадрата.

Оценка токсического действия химического соединения или тестируемой воды делается на основании достоверности различий между показателями численности клеток водорослей в контроле и в опыте. При этом вычисляют [2]:

а) средние арифметические величины численности клеток - Xi и X (из двух и шести подсчетов, соответственно).

б) численность клеток в процентах от контроля. Сумма (X - Xi)

в) среднее квадратичное отклонение (б):

"Формула"

где n - количество повторностей; в данном случае (см. табл.3.1) n = 3;

в) ошибку среднего арифметического (X): S = б/корень из n;

г) Td - критерий достоверности различий двух сравниваемых величин:

"Формула"

  _  _

где Xk и Хо - сравниваемые средние величины (в контроле и опыте),

  2  2

  Sk - So  - квадраты ошибок средних в контроле и опыте.

Td рассчитывают на каждые сутки и сравнивают с табличной величиной Tst - стандартным значением критерия Стьюдента. В данном случае (табл. 3.1) для его определения принимают уровень значимости Р = 0,05 и степень свободы (n1 + n2 - 2), т. е. (3 + 3 - 2) = 4. Tst при степени свободы 4 равно 2,78.

Если Td больше или равно Tst, то различие между контролем и опытом достоверно - тестируемая вода загрязнена (токсическое или эвтрофирующее загрязнение)

Если Td меньше Tst, то различие между контролем и опытом не достоверно - тестируемая вода не загрязнена.

Для расчетов Td можно использовать калькуляторы типа МК-51 и МК-71, а также компьютерные электронные таблицы (например, программу "Сигма" ЦСИАК), что значительно ускоряет работу.

Для графического представления результатов биотестирования по оси абсцисс откладывают время в сутках, а по оси ординат либо число клеток водорослей в 1 мл, либо число клеток водорослей в процентах от контроля.

3.4. Биотестирование сточной (природной) воды на водоросли
Scedesmus Quadricauda

Биотестирование в колбах (100 МЛ):

A. Добавить последовательно в 300 мл тестируемой сточной воды (опыт) 0,3 мл KNO3, 0,3 мл MgSO4, 0,3 мл Ca(NO3)2, 0,3 мл КН2РО4, 0,3 мл К2СО3.

Добавить последовательно в 300 мл тестируемой дистиллированной воды (контроль) 0,3 мл KNO3, 0,3 мл MgSO4, 0,3 мл Ca(NO3)2, 0,3 мл КН2РО4, 0,3 мл К2СО3.

Б. Добавить в обе колбы (контроль и опыт) суспензию водорослей до концентрации 200-300 тысяч клеток, мл (не более 500 тысяч/мл!).

B. Разлить по колбам по 100 мл:

опыт 3 колбы - N 1, N 2, N 3.

контроль 3 колбы - N 4, N 5, N 6.

Г. Считать ежедневно после интенсивного встряхивания содержимого колб.

Биотестирование в пузырьках (10 мл):

А. Добавить последовательно в 30 мл тестируемой сточной воды (опыт) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КH2PО4, 30 мкл К2СО3.

Таблица 3.1

Определение устойчивости Scenedesmus Quadricauda
к действию бихромата калия

Добавить последовательно в 30 мл дистиллированной воды (контроль) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КН2РО4, 30 мкл К2СО3.

┌───────┬────────┬───────────────┬──────┬──────┬────────┬──────┬──────┬───────────┬─────┬──────┬─────┬────┐

│N  пов-│Конц-ция│ Кол-во клеток │  Хi  │  Х  │  % от  │ _ _  │ _ _ 2│  _ _ 2│  │  │  2 │  │

│торнос-│K2Cr2O7,│  водорослей  │  │  │контроля│(Х-Хi)│(Х-Хi)│Сумма(Х-Хi)│  б  │  S  │  S  │ Td │

│тей  │мг/л  ├───────┬───────┤  │  │  │  │  │  │  │  │  │  │

│  │  │Сетка 1│Сетка 2│  │  │  │  │  │  │  │  │  │  │

├───────┴────────┴───────┴───────┴──────┴──────┴────────┴──────┴──────┴───────────┴─────┴──────┴─────┴────┤

│Дата начала опыта ___________________, рН = 7,4  │

├─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┤

│1-е сутки после начала опыта, рН 7,8  │

├───────┬────────┬───────┬───────┬──────┬──────┬────────┬──────┬──────┬───────────┬─────┬──────┬─────┬────┤

│  N 1  │  10  │  20  │  23  │ 21,5 │  │  │  1,8 │ 3,24 │  │  │  │  │  │

├───────┼────────┼───────┼───────┼──────┼──────┼────────┼──────┼──────┼───────────┼─────┼──────┼─────┼────┤