Лечение травматической болезни спинного мозга с использованием клеточных технологий (стр. 4 )

  Твердая мозговая оболочка тщательно и герметично ушивается. Проводится послойное ушивание операционной раны с обязательным ее дренированием.

  В качестве иллюстраций приводим следующие наблюдения.

  Больная Лва, 17 лет. И/б №04/00116. Диагноз: Последствия тяжелой позвоночно-спинальной травмы, компрессионного перелома Th8-9 позвонков, вывиха Th8 позвонка. Нижняя параплегия. Нарушение тазовых функций. Состояние после многократных оперативных вмешательств.

  Из анамнеза известно, что травма получена в 1998 году. Через 5 часов после травмы выполнена ламинэктомия Th8-9 с ревизией позвоночного канала. Через 2 месяца после травмы повторная операция - выправление клина Урбана, иссечение посттравматической кисты и установка нйростимулятора. Курс стимуляции продолжался 1 месяц. В октябре 1998 года? Установлена винтовая стабилизирующая система. Через 8 месяцев система удалена из-за угрозы инфицирования. После этого у больной сформировался грубый кифосколиоз. Неврологические нарушения оставались без динамики на фоне проводимого лечения. В 1999 году произведена транплантация фетальных клеток в субарахноидальное пространство. Состояние больной оставалось стабильно тяжелым, без динамики в неврологическом статусе.

  В неврологическом статусе: сознание ясное. Зрачки равные, средней величины, равные. Фотореакция живая, D=S. Лицо симметричное. ЧМН без патологии. Мышечный тонус в верхних конечностях физиологический. Отмечается повышение сухожильных рефлексов с рук с умеренной S=D. Двигательных и чувствительных нарушений в верхних конечностях нет. Брюшные рефлексы не вызываются. Нижняя параплегия с низким мышечным тонусом. Рефлексы с ног повышены, рефлекторные зоны расширены, клонус левой стопы. Проводниковая анестезия всех видов чувствительности с дерматома Th12 с обеих сторон. Двухсторонние патологические знаки. Нарушение функции тазовых органов по центральному типу.

  02.06.04 произведена операция - транспедикулярная фиксация L3-L4, фиксация крючками Th10-11. Реконструкция дефекта спинного мозга с использованием сферогеля под контролем эндоскопа.

  После кожного разреза, скелитированы остистые отростки Th9-L4. Под контролем ЭОП произведена установка транспедикулярной системы на уровне L3-4. На уровне Th10-11 в область междужковых пространств заведены до заклинивания 4 крючка. Конструкция сформирована из 2-х продольных и 2-х поперечных балок. Выше уровня Th12 произведена гемиламинэктомия, обнажена неизмененная т. м.о, которая вскрыта. Осуществлен менингомиелорадикулолиз до появления свободного тока ликвора. Убедительно интраоперационно при использовании эндоскопа структуры спинного мозга на протяжении Th9-L2 не обнаружены (диастаз до 6см). В образовавшийся дефект имплантирован сферогель(3мл) в композиции с аутологичными стволовыми клетками.

  Твердая мозговая оболочка ушита.

  Послеоперационный период протекал без осложнений. Рана зажила первичным натяжением.

При МРТ исследовании:

При КТ-миелографии:

  При контрольном осмотре через 5 месяцев. У больной отмечалась отчетливая положительная динамика в виде снижения уровня чувствительных расстройств на 20 см вниз, также появилась способность двигать пальцами правой стопы. Отмечаются элементы двигательной активности в глубоких мышцах бедер с 2-х сторон до 2 баллов. По шкале ASIA - A переход в D. По шкале FIM (с

  Больная Вна, 20 лет. И/б №02/0004. Диагноз: Последствия тяжелой позвоночно-спинальной травмы. Компрессионный перелом тела L1 позвонка со сдавлением спинного мозга от 0.6.2000г. Нижняя параплегия. Нарушение тазовых функций. Состояние после многократных хирургических операций.

  Из анамнеза известно, что 6 апреля 2000 года упала с высоты 5 этажа. При поступлении в Ставропольский край" href="/text/category/stavropolmzskij_kraj/" rel="bookmark">Ставропольскую краевую больницу был диагностирован компрессионный перелом L1 позвонка с компрессией позвоночного канала и множественные переломы ног. Сразу проявился нижний вялый парапарез до плегии с уровня L1, нарушение функции тазовых органов и нарушение чувствительности: в правой ноге с уровня L3, слева - только на стопе. Там же была оперирована: выполнили заднюю декомпрессия спинного мозга на уровне перелома L1 позвонка. Затем в ЦКГ ВМФ РФ выполнена стабилизирующая операция: устранение клина Урбана и фиксация ниже и вышележащих сегментов с помощью системы Horizon фирмы Sofamor Danek. Со слов больной, после этой операции наступило ухудшение в виде исчезновения болевой чувствительности в ногах, исчезло суставно-мышечное чувство в правой ноге. Затем с целью электростимуляции спинного мозга был имплантирован электростимулятор, работа которого вызывала сильный болевой синдром. 17.09.02. в клинике "Нейровита" электростимулятор был удалён. При неоднократных люмбальных пункциях ликвор получить не удалось из-за полного блока субарахноидального пространства. 16.10.02. была выполнена операция - ревизия стабилизирующей конструкции SOFAMOR DANEC и спинного мозга, удалены остатки электростимулятора и правого нижнего ламинарного крючка, выполнен менингомиелорадикулолиз. При интраоперационной стимуляции корешков конского хвоста установлено, что моторное проведение сохранено. На фоне проведённых операций и консервативной терапии у больной исчезли болевые ощущения, связанные с электростимулятором, и дискомфорт от прикосновения спины к постели или спинке кресла. Изменился уровень чувствительности, но, вместе с тем, появилась непостоянная боль в правой ноге и ягодицах, которые к настоящему поступлению прошли.

  В неврологическом статусе: сознание ясное. ЧМН без патологии. В верхних конечностях без двигательных, чувствительных и рефлекторных нарушений. Движения в ногах отсутствуют. Сухожильные рефлексы с нижних конечностей не вызываются. Патологических стопных знаков нет.

  Анестезия с уровня Th12 в правой половине тела, в левой - с уровня L1. При прикосновении к ногам могут возникать перекрёстные парестезии на симметричной области в виде жжения, мурашек. Суставно-мышечное чувство отсутствует.

  Больной, после проведения предоперационной подготовки, 28.07.2004 года произведена операция - удаление транспедикулярной фиксации на нижнегрудном - поясничном уровне с одномоментной операцией- реконструкция спинного мозга с помощью биодеградирующего геля "Сферогель" с использованием аутологичных стволовых клеток в рамках отраслевой программы "клеточные технологии-медицине".

  При контрольном осмотре через 8 месяцев положительной динамики выявлено не было.

  Заключение: недостаточное количество пациентов не позволяет достоверно оценить эффективность нейрохирургического метода применения клеточной нейротрансплантации.
  В 50% случаев у больных с отсутствием эффекта от традиционной методики лечения спинальной травмы было отмечено объективное улучшение состояния после введения "Сферогеля".
  Другим аспектом анализа представленных случаев является необходимость применения нейротрансплантации в комплексе с классическими нейроортопедическими принципами.

  Таким образом, в дальнейшем является перспективным использование данного метода с целью получения достоверного и доказательного материала.

При КТ-исследовании:

При МРТ-миелографии:

На спондилограммах:

Изменения электронейромиографических показателей при клеточной реконструкции МСК нейрональной ткани

  По данным литературы у пациентов, с поврежденным спинным мозгом, через несколько месяцев после травмы в периферических нервах начинает развиваться дегенеративный процесс (вторичная дегенерация нейронов), который в конечном итоге заканчивается их гибелью. Этот процесс можно объективизировать с помощью электронейромио-графического исследования. На начальной стадии отмечается снижение амплитуды М-ответа, снижение скорости проведения и удлинения латентного периода М-ответа. На поздней стадии зарегистрировать М-ответ не удается. Считается, что развитие вторичной дегенерации связано с тем, что в результате травмы спинного мозга происходит разобщение надсегментарных и сегментарных структур, следствием чего является нарушении трофики периферических нервов. Это приводит в дальнейшем к их гибели.

  Анализируя данные ЭНМГ пациентов до и после введения МСК, нами не было отмечено изменений нейрофизиологических показателей, что вероятно связано с начинающим восстановлением проводящих путей спинного мозга и как следствие уменьшению трофических нарушений в периферических нейронах.

  Рис. 1.Зависимость амплитуды М-ответа (мВ) от возраста.
 Анализ проводился методом ANOVA.

  Рис. 2.Зависимость латентного периода М-ответа (мс) от возраста.
 Анализ проводился методом ANOVA.

  В тоже время, несмотря на то, что клиническая картина пациентов со спинальной травмой не различается в зависимости от возраста, полученные электронейромиографические показатели свидетельствуют о том, что в разных возрастных группах имеются отличия в показателях амплитуды и латентного периода М-ответа (рисунок 1,2).

  Амплитуда М-ответа у пациентов моложе 29 лет (3,8 мВ) выше, чем у пациентов старше 29 лет (2,4 мВ). Латентный период длиннее у молодых (5,35 мс), чем у пациентов старше 29 лет (4,6 мс).

  Возможно это связано с тем, что у пациентов до 29 лет первично в процессе дегенерации лежит демиелинизирующий процесс, что вполне может быть связано с развитием аутоиммунных процессов в периферической нервной системы. Тогда как у пациентов старше 29 лет первично начинается дегенерация собственно аксона и только в дальнейшем вторично развивается демиелинизация. Однако для этого требуется проведение дополнительных исследований.

  Используя дисперсионный метод анализа (рисунок 3), мы получили данные, что возможно до 1 года - амплитуда у пациентов снижается, от 1 года до 5- повышается, после 5 лет вновь отмечается снижение амплитуды (2,3; 3,8 и 1,7 мВ, р<О, О5 соответственно).
  По нашему мнению это связано с тем, что до 1 года, на фоне остро развившейся деиннервации периферических нервов, дегенеративные процессы преобладают над репаративными. После 1 года включаются, пока нам неизвестные, восстановительные процессы, следствием чего является повышение амплитуды М-ответа. При длительности процесса свыше 5 лет наступает истощение данных механизмов и амплитуда вновь снижается. Использование дисперсионного метода анализа позволило предположить, что возможно группа пациентов с давностью травмы от 1 года до 5 является наиболее прогностически благоприятной для лечения МСК. Однако это можно подтвердить только на большей группе пациентов.

Рис. 3.Дисперсионный анализ данных по амплитуде М-ответа (мВ) ЭНМГ
нижних конечностей и давности травмы.

  Таким образом, несмотря на небольшое количество больных, нам удалось сделать предположение, что отсутствует отрицательная динамика электронейромиографических показателей после цитотрансфузии МСК. Возможно, это связано с тем, что стволовые клетки способствуют активации репаративных процессов не только в центральной нервной системе, но и периферической, тем самым, уменьшая, а может быть, и прекращая развитие дегенеративных изменений.

Оценка восстановления мочевыводящих путей с помощью уродинамических проб

  Мочеиспускание является сложным рефлекторным актом, в регуляции которого принимают участие чувствительная, соматическая и вегетативные отделы нервной системы, а также корковые структуры и подкорковые ядра центральной нервной системы.

  При полном функциональном перерыве спинного мозга контроль со стороны головного мозга на активность мочевыделительной системы отсутствует, что приводит к нарушению акта мочеиспускания.

  100% исследуемых нами больных имели нарушения функций мочевыделительной системы. Из них 61% имели истинное недержание мочи, 39 - императивные позывы на мочеиспускание.

Рис.1 Динамика изменений комплайнс 1 и первого ощущения наполнения мочевого пузыря.

  По данным уродинамических проб у больных с нарушениями функций тазовых органов улучшилось чувствительность детрузора по параметру первого ощущения наполнения мочевого пузыря и адаптационные способности детрузора по данным комплайнс 1.

  Полный или частичный функциональный перерыв спинного мозга характеризуется снижением афферентации и эфферентной составляющий рефлекторной дуги, замыкающейся на уровне головного. Достоверное улучшение чувствительности детрузора свидетельствует о восстановлении глубокой чувствительности от рецепторов мочевого пузыря. Увеличение адаптационных возможностей детрузора свидетельствует о формировании контроля над парасимпатическим отделом вегетативной нервной системы со стороны корковых и подкорковых структур головного мозга, что свидетельствует о восстановлении эфферентной части рефлекторной дуги, участвующий в контроле акта мочеиспускания. Таким образом, полученные достоверные изменения уродинамических показателей с одной стороны являются подтверждением тех субъективных изменений, которые отмечают больные после применения МСК. С другой стороны, является инструментальным методом, позволяющим объективно оценить результаты репаративных изменений со стороны проводящих путей спинного мозга на фоне применения МСК.

  В качестве примера эффективности трансфузии МСК представляется следующий клинический случай:

  17 лет поступил в клинику 29.04.04. с диагнозом: последствия тяжёлой позвоночно-спинномозговой травмы, перелома С6 позвонка. Нижняя вялая параплегия, недержание мочи. После двукратного введения МСК по данным уродинамических проб:

исследуемые параметры	уродинамическое исследование№ 1 (19.05.04)	уродинамическое исследование№ 2 (31.03.05)
первое ощущение наполнения мочевого пузыря	цистометрический объем - 56 мл; P det. - 9 см. водн. ст	цистометрический объем - 16 мл; P det. - 1 см. водн. ст
нормальный позыв к мочеиспусканию	цистометрический объем - 85 мл; P detсм. водн. ст	цистометрический объем - 199 мл; P detсм. водн. ст
сильный позыв к мочеиспусканию	цистометрический объем - 93 мл; P detсм. водн. ст	-
комплайнс 1 цистометрический объем - 80 мл	8,0 (мл/см. водн. ст)	20,0 (мл/см. водн. ст)
комплайнс 2 (максимальная цистометрическая емкость)	1,24 (мл/см. водн. ст)	2,67 (мл/см. водн. ст)
максимальная цистометрическая емкость	93 мл	199 мл
ЭМГ	появление эпизодов ЭМГ активности при мочеиспускании	появление эпизодов ЭМГ активности при мочеиспускании
наличие эпизодов непроизвольного сокращения детрузора	непроизвольное сокращение детрузора до 77 см водн. ст.	непроизвольное сокращение детрузора до 67 см водн. ст.

 
 

Цитометрия

 

  Как видно из таблицы, у пациента отмечается:
  - улучшение чувствительности детрузора
  - увеличение функциональной емкости мочевого пузыря
  - снижение детрузорного давления в фазу наполнения мочевого пузыря
  - улучшение адаптационной способности детрузора (увеличение комплайнс)
  - снижение амплитуды непроизвольных сокращений детрузора

Возможные механизмы действия МСК

  Эффективность мобилизации стволовых (CD34+) периферических клеток у больных с травматической болезнью спинного мозга.

  Хорошо известно, что в условиях спокойного, неповрежденного гемопоэза в периферической крови человека циркулируют стволовые гемопоэтические клетки, однако, их концентрация столь ничтожна (менее 0,01%), что их детальное изучение или, тем более, использование для целей трансплантации практически невозможны. Выход стволовых гемопоэтических клеток из центральных органов гемопоэза (костный мозг) наблюдается после травмирования гемопоэза (чаще всего, как результат химиотерапии), а также под действием колониестимулирующих факторов (КСФ). В клинике наибольшее распространение получили Г-КСФ (гранулоцитарный) и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный). Под действием этих факторов концентрация стволовых гемопоэтических клеток крови возрастает в раз, что позволяет собрать эти клетки и использовать для трансплантации. В ГУ РОНЦ имени РАМН накоплен большой опыт трансплантации аутологичных и аллогеннных ПСК (сотни онкологических больных). Сбор стволовых клеток в этих случаях осуществлялся для последующего восстановления гемопоэза после высокодозной химиотерапии. Как следствие предшествовавшей химиотерапии, костный мозг пациентов является к моменту проведения мобилизации в определенном смысле "истощенным", и эффективные мобилизации стволовых клеток (более 20 клеток в мкл крови) достигались не во всех случаях. Как правило, набрать необходимое для трансплантации количество клеток (2 х 106 /кг) удавалось за 2-3 сеанса лейкофереза.

  Следует отметить, что мобилизация стволовых клеток в периферическое кровеносное русло у больных с травматической болезнью спинного мозга была эффективной в большинстве случаев - как абсолютное, так и процентное содержание CD34+ клеток в лейкоконцентратах, получаемых за 1 сеанс лейкафереза, соответствовало таковому, необходимому для трансплантации (> 2 х 106 /кг).

1. Экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 на мобилизованных стволовых клетках крови больных с травматической болезнью спинного мозга.

  CD45 является интегральным показателем гемопоэтической природы клеток. Антиген экспрессирован на всех этапах дифференцировки клеток крови от незрелых предшественников до лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и т. д. Единственным исключением являются эритроциты. По мере созревания клеток крови экспрессия CD45 на них возрастает. Стволовые гемопоэтические клетки характеризуются различными уровнями экспрессии CD45 - от незначительной до выраженной. Наличие CD45 на стволовых гемопоэтических клетках крови и костного мозга положено в основу одного из наиболее известных протоколов определения этих клеток - ISHAGE.

Рисунок 2. Пример высокой пропорции CD45-негативных клеток (94%) в пределах CD34+ фракции мобилизованных стволовых клеток крови. А - характеристики светорассеяния клеток цитаферезного продукта. Б - стволовые клетки (CD34+) составляют 0,4% от всей клеточной популяции. В - пороговый уровень экспрессии CD45 определен по нижней границе позитивности гранулоцитов. Г - в пределах гейта R1 (стволовые, CD34+ клетки) лишь 6% клеток экспрессируют CD45, остальные клетки CD45-негативны. В пределах CD45- фракции видны клетки, полностью отрицательные по CD45, и клетки, которые приближаются к CD45-слабопозитивности. На точечных графиках А и В представлено 2000 событий, на графике Б -, на графике Г - 200 (0,4% от, гейт R1).

  Нами изучена экспрессия CD45 на мобилизованных стволовых клетках 15 больных с травмами спинного мозга. У большинства больных в пуле CD34+ клеток выявлялась отчетливая популяция CD45-негативных клеток, пропорция которой варьировала от 1% до 98% (в большинстве случаев - более 20%). Оценку процентного содержания CD45-негативных стволовых (СD34+) мобилизованных клеток крови осуществляли следующим образом. При анализе цитометрических данных в режиме Dot-plot выделяли гейт стволовых клеток CD34+ SSC-low, далее переходили в формат CD45-SSC для определения порогового уровня экспрессии CD45 на гранулоцитах (ниже этого уровня клетки считали отрицательными по CD45), далее в гейте CD34-позитивных клеток оценивали процент клеток отрицательных по CD45. Пример оценки CD45 на мобилизованных CD34+ клетках представлен на рисунке 2.

  В целом по анализируемой группе процент CD45-негативных клеток примерно у 60% больных в популяции мобилизованных стволовых клеток (CD34+) присутствовало более 20% CD45-негативных клеток, нередкую ситуацию представляли случаи, когда этих клеток было более 80-90% среди CD34-позитивных, как это показано на рисунке 2.

  Возникает вопрос, можно ли расценивать CD45-негативные стволовые (CD34+) клетки, как потенциально коммитированные по негемопоэтической линии. Ответ на этот вопрос неоднозначен. Разумеется, отсутствие или крайне слабая экспрессия CD45 еще не является 100%-ным доказательством негемопоэтической природы клеток. на самых ранних предшественниках гемопооэза экспрессия CD45 чрезвычайно слабая, и эти клетки часто становятся мишенями злокачественной трансформации при острых лейкозах. Вместе с тем, полностью исключить негемопоэтическую направленность дифференцировки этих клеток также не представляется возможным. Хорошо известно, что в пуле мобилизованных CD34+ присутствуют негемопоэтические предшественники - эндотелиальные клетки, мезенхимные клетки. В пределах фракции CD38- HLA-DR-, которая составляет небольшую пропорцию CD34+ клеток, присутствуют клетки, способные дифференцироваться по мезенхимной линии. Для более детального изучения этого вопроса нами проведен анализ экспрессии CD38 и HLA-DR на мобилизованных CD34+ клетках крови больных с тяжелой травмой СМ.

2. Субпопуляции мобилизованных стволовых CD34+ клеток: экспрессия CD38 и HLA-DR

  Экспрессия молекул HLA-DR и CD38 изучена на мобилизованных стволовых клетках (CD34+) 12 больных травматической болезнью СМ.

Рисунок 3. Коэкспрессия молекул HLA-DR и CD38 на мобилизованных стволовых (CD34+) клетках крови. А - гейт стволовых CD34+ клеток, стволовые клетки составляют 0,44% от общего числа клеток. Б - контрольный образец окрашивания FL1 vs FL2 в гейте CD34+ клеток. В - 95% CD34+ клеток коэкспрессируют на мембране молекулы CD38 и HLA-DR, отмечается лишь незначительная пропорция клеток HLA-DR - CD38+ (2,3%). Г - контурный график, практически один кластер клеток CD38+ HLA-DR+, единичные события CD38+ HLA-DR-. В данном случае процент CD45-негативных стволовых клеток (CD34+) составил 65%.

  Пропорция этих клеток в большинстве случаев была незначительной (менее 9% у 10 больных) и лишь у 2 больных составила 16% и 23%. Как правило, отмечалась доминирующая фракция CD34+ клеток с гомогенной коэкспрессией CD38 и HLA-DR (рисунок 3).
  В 2 случаях отмечалась выраженная пропорция CD38- HLA-DR - клеток в пуле CD34+ мобилизованных стволовых клеток крови. Пример на рисунке 4.

  Рисунок 4. Выраженная пропорция CD38-HLA-DR - клеток в популяции мобилизованных стволовых (CD34+) клеток крови больного с тяжелой черепно-мозговой травмой. А - гейт стволовых клеток, Б - контрольное окрашивание, В - 23% CD34+ клеток являются негативными по экспрессии HLA-DR и CD38 (HLA-DR-CD38-). Г - контурный график, отчетливо видны 2 популяции CD34+ клеток - HLA-DR-CD38- и HLA-DR+CD38+. В данном случае 98% стволовых (CD34+) клеток не имели на мембране CD45.

  В обоих случаях с выраженной пропорцией HLA-DR-CD38- стволовых (CD34+) клеток большинство CD34+ клеток не имело на мембране CD45. В приведенном примере CD45-негативная фракция составила 98%. Это отчетливо указывает на существование CD45-CD38-HLA-DR - фракции среди мобилизованных стволовых CD34+ клеток крови у больных с травмой СМ.

  Во втором случае процент HLA-DR-CD38- клеток во фракции стволовых (CD34+) клеток составил 16%, при этом 56% CD34+ клеток были CD45-негативными. У этого пациента однозначно высказаться о наличии фракции CD34+HLA-DR-CD38-CD45- не представляется возможным.

  Мы провели дополнительные исследования по оценке коэкспрессии молекул CD38 и CD45, а также HLA-DR и CD45 на стволовых (CD34+) клетках.

Рисунок 5. Экспрессия HLA-DR и CD38 на CD45-негативных стволовых CD34+ клетках.

Рисунок 6. Пример присутствия фракции (51%) CD45- CD38- в пределах CD34+ клеток.

3. Экспрессия рецепторного комплекса gp130/80 на мобилизованных периферических стволовых клетках крови.

  Известно, что при культивировании стволовых (CD34+) клеток пуповинной крови в полужидких средах в присутствии СФ и комплекса ИЛ-6/sИЛ-6Р резко увеличивается количество колониеобразующих единиц, и изменяется их качественный состав: появляются многочисленные колонии крупного размера, более 60% которых относится к смешанным (ГЭММ) и бластным колониям, возрастает число мегакариоцитарных колоний и БОЕ-Э. МКА к gp130 и ИЛ-6Р эффективно блокируют колониеобразование, индуцированное комплексом ИЛ-6/sИЛ-6Р, оказывая наибольшее влияние на смешанные колонии [15].

  При выращивании стволовых клеток/клеток-предшественников (CD34+) человека в бессывороточных суспензионных культурах в присутствии ИЛ-6 и СФ добавление sИЛ-6Р дозозависимо увеличивало генерацию мегакариоцитов (IIb/IIIa+ клеток) [16]. Мегакарио-цитопоэз зависел от передачи сигнала через gp130 и не зависел от тромбопоэтина, т. к. полностью блокировался анти-gp130 МКА.

  Японскими учеными установлено, что стимуляция gp130 с помощью комплекса ИЛ-6/sИЛ-6Р способна поддерживать пролиферацию, дифференцировку и конечное созревание эритроидных клеток из очищенных CD34+ клеток человека в присутствии СФ. Это действие отменяется антителами к gp130 [17].

  CNTF (цилиарный нейротрофный фактор) также передает сигнал через gp130. Действие комплекса CNTF+растворимый рецептор во много сходно с действием комплекса ИЛ-6/ИЛ-6Р. Данный цитокин (ЦНТФ) поддерживает выживание отростчатых нейронов и двигательных нейронов, индуцирует дифференцировку олигодендроцитов в астроциты 2-го типа. ЦНТФ и его рецептор экспрессированы, главным образом, в нервной системе. Мы изучили показатели экспрессии и активации gp130 на мобилизованных стволовых клетках 10 больных с тяжелой травмой СМ. В качестве группы сравнения использованы данные, полученные на мобилизованных стволовых гемопоэтических клетках онкологических больных.

  Экспрессия рецептора gp130 (от слабой до умеренно положительной) имела место во всех изученных случаях. В то же время экспрессия-цепей (gp80) рецептора ИЛ-6 варьировала в широких пределах (от 1 до 60%), рисунок 3.

  Рис.3 Экспрессия эпитопов рецептора gp130/80 на мобилизованных стволовых клетках человека. А. Гейт (R1) стволовых клеток (CD34-FITC+/SSC-low), в котором проводилось изучение экспрессии рецептора. Б - Г. Окрашивание стволовых клеток меченными биотином МКА, затем - стрептавидином-Р окрашивание МКА к Т-клеточному рецептору / (1,6% неспецифического связывания). В. Окрашивание МКА М91 к - цепям рецептора ИЛ-6 (50,8% положительных клеток). Г. Окрашивание МКА С2 к рецептору gp130 (мономорфная положительная реакция). По оси ординат - интенсивность бокового светорассеяния (SSC). По оси абсцисс - на рис. 3А интенсивность FL1, на рис. 3Б - 3Г интенсивность FL2.

  Изучение 3 эпитопов рецептора gp130 (A1, C2, D1) указывало на то, что в отличие от перевиваемых клеточных линий интенсивность реакции одних и тех же клеток с различными МКА к gp130 могла варьировать. Так, нами отмечено, что в 3 из 15 изученных случаев плотность эпитопа А1 была значительно ниже, чем плотность эпитопа С2, что могло указывать на эндогенную активацию и димеризацию рецептора. В одном из этих трех образцов рецептор gp80 присутствовал на мембране стволовых клеток (60%), в двух других - отсутствовал (менее 12%). Следовательно, возможность активации gp130 без участия мембранной формы - цепей рецептора ИЛ-6 нельзя исключить. Пример активации gp130 представлен на рисунке:

Рисунок. Активированное состояние рецептора gp130: эпитоп С7 присутствует на всех клетках, эпитоп А1 - на части клеток.

  Оценка активации рецептора gp130 при добавлении к мобилизованным стволовым клеткам ИЛ-6 проведена в 12 образцах цитоконцентрата (Рисунок). Сложность подобного исследования обусловлена, с одной стороны, тем, что уровни CD34+ клеток в анализируемых образцах являются низкими (1-5%), а с другой - выраженной гетерогенностью уровней экспрессии -цепей рецептора ИЛ-6 на стволовых клетках%). Даже теоретически ожидать димеризацию gp130 под влиянием ИЛ-6 можно лишь на клетках, экспрессирующих рецептор для ИЛ-6. В случаях с низким содержанием gp80-позитивных стволовых клеток влияние ИЛ-6 на уровни экспрессии эпитопа А1 (снижение которых свидетельствует о димеризации gp130) может быть незначительным. С нашей точки зрения проведение подобных экспериментов представляется наиболее корректным в популяции очищенных CD34+CD126+(gp80) клеток.

  Изучили изменение уровней экспрессии молекулы gp130 (процент антигенположительных клеток в реакциях с МКА А1, D1, C2) на стволовых клетках под действием ИЛ-6. Достоверных колебаний среднего числа gp130-позитивных стволовых клеток, выявляемых с помощью МКА D1 и С2 не установлено (р > 0,05). Вместе с тем, средний процент А1-позитивных стволовых клеток после инкубации с ИЛ-6 достоверно снижался (t = 2,7; p = 0,02; n = 12). Этот результат не исключает димеризации gp130 на части стволовых гемопоэтических клеток под действием ИЛ-6. В настоящее время углубленный анализ этого вопроса нами проводится с учетом субпопуляционного состава стволовых клеток и экспрессии на них молекулы gp80.

  Анализ качественного состава мобилизованных стволовых клеток позволил установить высокую пропорцию клеток, негативных по экспрессии СD45, а также наличие выраженной фракции CD34+ HLA-DR- CD38-. Подобные иммунофенотипические характеристики характерны для наиболее ранних гемопоэтических клеток и мобилизованных клеток негемопоэтической природы.

  Рис. 3. Изменение уровней экспрессии эпитопов молекулы gp130 на мембране клеток линии под действием ИЛ-6. В обычных условиях культивирования все эпитопы молекулы gp130 (А1 в сайте димерзации, В1 в сайте присоединения - цепей рецептора ИЛ-6 и С7 в сайте молекулы gp130, не участвующем в функциональных взаимодействиях в ходе ИЛ-6-сигналинга) в равной мере экспрессированы на мембране клеток (сплошная линия). В качестве контроля использованы МКА к антигену CD7, отсутствующему на мембране клеток (заштрихованный пик). После добавления к клеткам ИЛ-6 (8 нг/мл; 30 мин, 4 С) исчезает реакция на А1 и В1 (пунктирная линия, практически не отличима от контроля) в то время как экспрессия эпитопа С7 остается неизменной (сплошная линия). Реакция непрямой иммунофлюоресценции. По оси абсцисс - интенсивность флуоресцентного сигнала. По оси ординат - количество клеток.