На правах рукописи
ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДЕЛЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА ПОЧЕК. ВЛИЯНИЕ ГАЛАВИТА
14.03.03 - патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владикавказ – 2013
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
БРИН Вадим Борисович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы Российской Федерации, заслуженный деятель науки РСО-Алания
Научный консультант:
КОЗЫРЕВ Константин Мурадиевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РСО-Алания
Официальные оппоненты:
ДЗУГКОЕВА Фира Соломоновна, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РСО-Алания, заместитель директора Института биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства РСО-Алания
ОВСЯННИКОВ Виктор Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный работник высшей школы Российской Федерации, заведующий кафедрой патологической физиологии государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится 25 июня 2013 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 при ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации ( 0)
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Автореферат разослан «24» мая 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Несмотря на успехи в изучении амилоидоза, эта проблема по-прежнему заслуживает определения, данного ей на I международном симпозиуме, посвященном амилоидозу (Гронинген, Нидерланды, 1967 г.). Тогда проблему амилоидоза сравнили со «сфинксом, о котором известно давно, но его сущность неизвестна человеку» ( и др., 2009 г.). Амилоидоз указывается в качестве одной из основных проблем здравоохранения западных стран (Fatma Briki, 2011), что обусловлено тяжестью клинических проявлений и склонностью к развитию почечной недостаточности (R. Rysava, 2007). Исходя из этого, создание новых моделей экспериментального амилоидоза у животных является перспективным, поскольку в настоящее время, несмотря на прогресс в изучении амилоидоза, нет эффективных средств, профилактики и лечения. В связи с этим поиск новых средств, обладающих высокой эффективностью и минимальным количеством побочных действий, является достаточно актуальным.
Механизм терапевтического действия галавита (МНН-аминодигидрофталазина дион натрия), модулятора функции макрофагов, обусловлен способностью препарата уменьшать синтез и секрецию провоспалительных цитокинов (TNF-фактора, ИЛ-1 и др.) гиперактивированными макрофагами, что достигается путем ингибирования в макрофагах синтеза РНК, ДНК и предотвращает развитие патологического процесса. Галавит ингибирует в легкой обратимой форме гиперактивность макрофагов лишь на время его применения ( и др., 1996). Учитывая концепцию патогенеза приобретенного амилоидоза, заключающуюся в том, что постоянно повышенное образование провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6 и фактора некроза опухоли TNF-a) вызывает значительное увеличение синтеза острофазного белка-предшественника, сывороточного А-амилоида (SAA), концентрация которого может повышаться в раз (H. J. Lachmann, H. J. Goodman, J. A. Gilbertson, J. R. Gallimore, C. A. Sabin, J. D. Gillmore, et al., 2007, T. Nakamura et al., 2006), обоснованным является выбор для профилактики развития амилоидоза препарата галавит. Как уже отмечалось, его основные фармакологические эффекты обусловлены способностью оказывать влияние на функционально-метаболическую активность макрофагов. Отечественными исследователями также подтверждено основное действие препарата – обратимое ингибирование на 4—6 ч избыточного синтеза гиперактивными макрофагами фактора некроза опухоли, интерлейкина (ИЛ) -1, других провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода (, , и соавт., 2001, , 2001, M. V. Nelyubov, 2002). Эти данные позволяют предположить, что галавит может оказывать тормозящее действие на процессы синтеза и отложения амилоида.
Таким образом, учитывая вышеизложенное, можно считать целесообразным изучение возможности применения галавита как перспективного средства для профилактики и коррекции нарушений при нефропатическом типе системного экспериментального амилоидоза.
Целью настоящего исследования было создание моделей экспериментального системного амилоидоза нефропатического типа, изучение функциональных, морфологических характеристик их патогенеза и анализ возможности корригирующего влияния галавита.
Задачи исследования. Для того чтобы достичь указанной цели, в работе решались следующие задачи:
1. Создание модели экспериментального системного нефропатического амилоидоза у хомяков методом длительного введения нативной человеческой плазмы.
2. Создание модели экспериментального системного нефропатического амилоидоза у хомяков методом однократного введения равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда.
3. Проведение функционального и морфологического сопоставления 2-х моделей амилоидоза.
4. Изучение характера функционально-морфологических изменений у хомяков, получавших в процессе моделирования амилоидоза галавит.
Новизна научной работы. Впервые разработаны методы моделирования амилоидоза путем длительного (60 дней) подкожного введения хомякам нативной человеческой плазмы в дозе 0,025 мл/г массы тела и однократного подкожного введения хомякам равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы в сочетании с адъювантом Фрейнда (из расчета по 0,1 мл в пять точек инъекций). Модели сопровождались развитием системного экспериментального амилоидоза с преимущественным поражением почек, а также печени и селезенки. Определены особенности развития амилоидной нефропатии, сопровождающейся оксидативным стрессом, протеинурией, снижением основных функциональных показателей почек: водо - и электролитовыделительной функций.
Установлено, что применение галавита значительно ослабляет степень протеинурии, изменений основных функциональных показателей почек (водо - и электролитовыделительной функции), а также выраженности оксидативного стресса, развившегося в ходе моделирования экспериментального амилоидоза. Уменьшается выраженность отложения фибриллярных белков амилоида в стромально-сосудистых структурах, преимущественно в почках, а также в селезенке и печени.
Новизна работы подтверждена тремя патентами (патент №2 №2 № 000).
Научно-практическая значимость работы. Данное исследование носит экспериментальный характер. Результаты относятся к области фундаментальных знаний, поскольку дают возможность раскрыть патогенетические механизмы развития наиболее часто встречающейся формы амилоидоза (вторичного АА-амилоидоза) и вести поиск новых эффективных фармакологических средств, обладающих профилактическим и лечебным действием. Полученные результаты исследования свидетельствуют о положительном предупреждающем влиянии галавита на формирование экспериментального нефропатического амилоидоза, что расширяет представления о возможностях моделирования амилоидоза и способствует более глубокому изучению и пониманию этиологии и патогенеза.
Таким образом, полученные результаты могут стать основополагающими для разработки способов профилактики и лечения амилоидоза не только в эксперименте, но и у человека путем последующих исследований. Полученные результаты могут быть использованы при преподавании патофизиологических и гистоструктурных основ стромально-сосудистых диспротеинозов на кафедрах патологии и нефрологии медицинских вузов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Длительное (60 дней) подкожное введение хомякам нативной человеческой плазмы в дозе 0,025 мл/г массы тела животного через день сопровождается развитием системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, а также селезенки и печени.
2. Однократное введение хомякам равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы в сочетании с адъювантом Фрейнда также сопровождается развитием системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, а также селезенки и печени. Развитие экспериментального системного амилоидоза приводит к оксидативному стрессу, протеинурии, нарушению водо - и электролитовыделительной функций почек.
3. Использование галавита одновременно с длительным введением нативной человеческой плазмы, а также однократным равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда способствует уменьшению выраженности гистоструктурных признаков поражения почек, селезенки и печени.
4. Применение галавита способствует частичному восстановлению основных функциональных показателей почек (водо - и электролитовыделительной функций), уменьшению степени протеинурии, а также снижению интенсивности процесса ПОЛ. Эффективность применения галавита при обеих моделях экспериментального амилоидоза примерно одинакова.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно выполнена работа по получению экспериментальных данных, изложенных в диссертации. Проведена математическая и статистическая обработка результатов исследования. Проанализированы и обобщены полученные результаты.
Публикации и апробация диссертационной работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, из которых 4 в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования России.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на II международной конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011), X Конференции молодых ученых ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ (Владикавказ, 2011).
Структура диссертации работы. Диссертация изложена на 123 страницах, иллюстрирована 41 рисунками и 12 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, списка использованной литературы и приложения. Библиографический указатель включает 202 источников, из них 166 - зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал и методы исследования. Опыты проводились на 130 сирийских хомяках-самцах массой 100-150 г. Для проведения эксперимента использовались самцы для исключения возможных гормональных циклов, которые могут отмечаться у самок. Экспериментальные животные на период исследований содержались в условиях свободного доступа к пище и воде на стандартном рационе, световой режим был естественный.
Эксперименты проводились в 6 сериях опытов. Одна из моделей амилоидоза создавалась путем введения нативной человеческой плазмы инъекциями под кожу из расчета 0,025 мл/г массы тела животного через день на протяжении 60 дней. Вторая модель создавалась однократным подкожным введением равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда в дозе по 0,1 мл в пять точек инъекций (подмышечные и паховые области слева и справа, и внутрибрюшинно). Галавит вводился подкожно в дозе 0,28 мг/кг через день в течение 60 дней. С целью контроля использовались интактная группа экспериментальных животных, а также группа с изолированным введением одного галавита в той же дозе.
Исследования основных показателей во всех опытах в группах животных проводилось через один и два месяца эксперимента. Функция почек изучалась в условиях спонтанного диуреза, когда животные помещались в обменные клетки, где у них собиралась моча в течение 6 часов. Затем проводилось исследование мочи на концентрацию натрия, калия, кальция, креатинина и общего белка.
По окончании срока эксперимента животные забивались под наркозом (тиопенталовым). Проводилось исследование крови и тканей. В крови определялись концентрация показателей оксидантной и антиоксидантной систем, в плазме крови - содержание Na, К, Са, креатинина.
При проведении экспериментальной работы руководствовались 11 Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 000 от 01.01.2001 г.).
Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин с дальнейшим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Затем срезы подвергались окрашиванию конго красным и изучались в проходящем свете с помощью микроскопа «Микмед – 1» под увеличением х200, х400, х600.
Определение концентрации натрия и калия в моче и плазме крови (по истечении 2-х месяцев эксперимента) проводилось методом пламенной фотометрии (автоматическим пламенным фотометром ФПА-2), кальция - спектрофотометрически (СФ-26) набором «Кальций» -Мед» (г. Москва, Россия). Анализ концентрации креатинина в моче и плазме крови (по истечении 2-х месяцев эксперимента) проводился спектрофотометрически набором «Креатинин» Диагностикум» (г. Санкт-Петербург, Россия). Определение скорости клубочковой фильтрации проводилось по клиренсу эндогенного креатинина, рассчитывалась канальцевая реабсорбция воды. Содержание белка определяли спектрофотометрически (UNICO 2800) с использованием реактива Фоллина (, , 1979). Определение скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды, показателя почечной обработки катионов проводилось по общепринятым формулам (, 1974).
Определение нижеизложенных показателей проводилось спектрофотометрически (UNICO 2800): концентрации перекисей липидов в крови - методом , , Маж3); содержания малонового диальдегида в эритроцитах - методом образования окрашенного комплекса с ТБК (, 2003); активности каталазы в эритроцитах - методом E. Beutler (под ред. , 2003).
Математическую обработку результатов исследований во всех сериях опытов проводили на ПЭВМ Pentium-4 методом вариационного анализа по «t» критерию Стьюдента с использованием программы «GraphPad Prism 4.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Моделирование амилоидоза с помощью длительного введения амилоидогена. Эффекты галавита. Изучение основных процессов мочеобразования показало, что у животных при моделировании амилоидоза длительным введением нативной человеческой плазмы через 1 месяц эксперимента отмечалось повышение диуреза относительно интактного фона, что было обусловлено снижением канальцевой реабсорбции воды на фоне увеличения скорости клубочковой фильтрации (СКФ). По истечении 2-х месяцев эксперимента наблюдалось достоверное снижение диуреза (р<0,001), обусловленное понижением СКФ (р<0,001) ниже значений интактной группы животных, несмотря на достоверное уменьшение канальцевой реабсорбции воды (р<0,001) (рис. 1).
Рис. 1. Изменения основных процессов мочеобразования при моделировании амилоидоза и его профилактике
Изучение ионоуретической функции почек на фоне длительного введения амилоидогена экспериментальным животным выявило постепенное снижение экскреции натрия - статистически достоверное к концу второго месяца эксперимента (р<0,001), что было обусловлено достоверным уменьшением фильтрационного заряда катиона и тенденцией к понижению концентрации натрия в плазме крови, при этом происходило и снижение его канальцевой реабсорбции. Экскреция калия через 1 месяц эксперимента несколько повышалась. Спустя 2 месяца отмечалось достоверное снижение экскреции катиона с мочой, вероятно, за счет изменения канальцевых процессов на фоне уменьшения фильтрационного заряда калия (таблица 2). При этом концентрация калия в плазме крови не менялась. По истечении 1 месяца эксперимента отмечалась тенденция к повышению экскреции кальция по отношению к интактной группе животных (таблица 1), но уже через 2 месяца эксперимента экскреция катиона достоверно снижалась (р<0,001), что было обусловлено уменьшением фильтрационного заряда, а также его содержания в плазме крови, несмотря на снижение канальцевой реабсорбции катиона.
В результате длительного введения амилоидогена через 2 месяца эксперимента наблюдалось статистически достоверное увеличение продуктов перекисного окисления липидов (концентрации гидроперекисей в крови, содержания малонового диальдегида в эритроцитах) относительно интактной (контрольной) группы животных, что косвенно отражало развитие оксидативного стресса на фоне угнетения антиоксидантной системы, поскольку выявлялось достоверное снижение активности каталазы в эритроцитах (рис. 3).
Под влиянием длительного введения нативной человеческой плазмы сирийским хомякам отмечалось нарастающее увеличение протеинурии более чем в 2 раза на протяжении двух месяцев эксперимента (таблица 3).
Таким образом, подкожное введение нативной человеческой плазмы хомякам в течение 2 месяцев эксперимента в дозе 0,025 мл/г массы тела вызывает протеинурию, снижение основных процессов функциональных показателей почек: водо - и электролитовыделительной функций, развитие оксидативного стресса, что, очевидно, обусловлено развитием амилоидной нефропатии в эксперименте.
С целью изучения влияния галавита на функциональное состояние почек у сирийских хомяков при амилоидной нефропатии было проведено контрольное исследование животных с изолированным введением галавита. При введении галавита в дозе 0,28 мг/кг массы тела животного отмечалась некоторая тенденция к увеличению диуреза на фоне незначительных сдвигов канальцевой реабсорбции воды, а также скорости клубочковой фильтрации относительно фона. Изучение электролитовыделительной функции почек выявляло статистически незначительное увеличение экскреции электролитов и их концентрации в плазме крови, достоверно не отличающееся от фоновых значений. Состояние оксидантной и антиоксидантной систем и степень протеинурии при изолированном введении галавита также достоверно не менялись.
Профилактическое применение галавита на фоне длительного введения амилоидогена экспериментальным животным в течение первого месяца способствовало снижению диуреза по отношению к амилоидной группе животных на фоне достоверного увеличения канальцевой реабсорбции воды. Через 2 мес. эксперимента отмечалось увеличение диуреза относительно группы с введением нативной человеческой плазмы, и его объем приближался к фоновым значениям, что было обусловлено восстановлением скорости клубочковой фильтрации (рис. 1).
Изучение ионоуретической функции почек на фоне применения галавита при моделировании амилоидоза длительным введением нативной человеческой плазмы способствовало постепенному увеличению экскреции натрия, статистически достоверному по истечении 2-х месяцев эксперимента. Показатель экскреции приближался к фоновым значениям, что было обусловлено увеличением фильтрационного заряда катиона вследствие роста скорости клубочковой фильтрации. Восстанавливалась и концентрация натрия в плазме крови. При этом отмечалось повышение канальцевой реабсорбции катиона (таблица 2). Экскреция калия через 1 месяц эксперимента была несколько выше данных амилоидной группы животных и ниже фоновых значений (таблица 1). Спустя 2 месяца эксперимента экскреция калия достоверно повышалась как относительно фоновых значений, так и относительно группы животных с амилоидной нефропатией на фоне восстановления фильтрационного заряда катиона (таблица 2). Концентрация калия в плазме крови не отличалась от данных интактной группы животных. На фоне длительного введения амилоидогена применение галавита приводило к увеличению экскреции кальция по отношению к амилоидной группе животных после первого месяца исследования (таблица 1). Через 2 месяца одновременного введения амилоидогена и галавита уровень экскреции кальция оказался достоверно выше группы животных с моделированием амилоидоза и значений интактной группы животных, что было обусловлено восстановлением фильтрационного заряда катиона и повышением концентрации кальция в крови. Канальцевая реабсорбция катиона также восстанавливалась до нормального уровня (таблица 2).
Изучение состояния оксидантной и антиоксидантной систем на фоне профилактического применения галавита при длительном введении амилоидогена показало, что по истечении 2 месяцев эксперимента концентрация гидроперекисей в крови достоверно снижалась относительно группы животных с изолированным введением амилоидогена, однако оставалась несколько выше фоновых значений экспериментальных животных; содержание малонового диальдегида в эритроцитах достоверно снижалось относительно данных амилоидной группы животных, приближаясь к фоновым значениям, что свидетельствовало о снижении интенсивности процесса ПОЛ. Также отмечалось достоверное повышение активности каталазы в эритроцитах относительно данных амилоидной группы животных, что указывало на активацию антиоксидантной системы (рис. 3).
Содержание белка в моче относительно амилоидной группы животных снизилось через 2 месяца эксперимента почти в 2 раза (таблица 3).
Профилактическое применение галавита при моделировании амилоидоза длительным введением нативной человеческой плазмы уменьшает нарушения основных функциональных показателей почек (водо - и электролитовыделительной функций), а также значительно снижает степень протеинурии, ПОЛ на фоне активации АОЗ.
2. Моделирование амилоидоза с помощью однократного введения амилоидогена вместе с адъювантом Фрейнда. Эффекты галавита. Изучение основных процессов мочеобразования при моделировании амилоидоза методом однократного введения равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда показало, что через 1 месяц эксперимента снижение канальцевой реабсорбции воды (р<0,001) способствовало достоверному повышению диуреза у животных относительно интактного фона (рис. 1). Через 2 месяца диурез (р<0,001) достоверно снижался ниже фона, что было обусловлено понижением СКФ (р<0,001), при этом снижалась и канальцевая реабсорбция воды (р<0,001).
При изучении ионоуретической функции почек на фоне однократного введения амилоидогена экспериментальным животным, выявлено постепенное снижение экскреции натрия, к концу второго месяца эксперимента ставшее статистически достоверным, обусловленное уменьшением фильтрационного заряда катиона и его концентрации в плазме крови, при этом отмечалось и снижение канальцевой реабсорбции натрия (таблица 2). Через 1 месяц эксперимента экскреция калия имела лишь тенденцию к повышению по отношению к интактной группе животных (таблица 1). Спустя 2 месяца отмечалось достоверное снижение экскреции катиона с мочой, вероятно, за счет изменения канальцевых процессов на фоне уменьшения фильтрационного заряда калия (таблица 2). При этом концентрация калия в плазме крови незначительно повышалась. Экскреция кальция по истечении 1 месяца эксперимента имела тенденцию к повышению в сравнении с интактной группой животных (таблица 1). Спустя 2 месяца эксперимента экскреция кальция снижалась (таблица 2), что обусловлено уменьшением фильтрационного заряда, а также его содержания в плазме крови. При этом канальцевая реабсорбция кальция также достоверно снижалась.
Моделирование амилоидоза методом однократного введения амилоидогена по истечении 2-х месяцев эксперимента сопровождалось статистически достоверным повышением продуктов перекисного окисления липидов (концентрации гидроперекисей в крови, содержания малонового диальдегида в эритроцитах) относительно интактной группы животных, что косвенно отражало развитие оксидативного стресса на фоне достоверного снижения активности каталазы в эритроцитах и свидетельствовало об угнетении антиоксидантной системы (рис. 3).
Однократное введение равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда через 1 и 2 месяца эксперимента вызывало достоверное увеличение экскреции белка с мочой выше фоновых значений, особенно по истечении 2 месяцев (таблица 3).
Таким образом, введение равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда (однократно) сирийским хомякам вызывает развитие системного амилоидоза нефропатического типа, сопровождающееся протеинурией, снижением основных функциональных показателей почек (водо - и ионовыделительной функций), развитием оксидативного стресса.
Профилактическое применение галавита при моделировании амилоидоза методом однократного введения нативной человеческой плазмы в сочетании с адъювантом Фрейнда способствовало уменьшению диуреза относительно амилоидной группы животных по окончании 1 месяца эксперимента за счет увеличения канальцевой реабсорбции, несмотря на то что скорость клубочковой фильтрации оставалась достоверно ниже фона (р<0,01). По истечении 2 мес. эксперимента отмечалось повышение диуреза, его объем приближался к интактному фону, что было обусловлено увеличением клубочковой фильтрации (р<0,001) (рис. 1).
Изучение ионоуретической функции почек на фоне применения галавита при моделировании амилоидоза методом однократного введения амилоидогена через 1 месяц эксперимента способствовало повышению экскреции натрия, статистически достоверному по истечении 2-х месяцев эксперимента относительно амилоидной группы животных. Величина экскреции натрия приближалась к фоновым значениям, что было обусловлено восстановлением фильтрационного заряда катиона (таблица 2). Также происходила нормализация канальцевой реабсорбции натрия и его содержания в плазме крови. Изучение экскреции калия по истечении 1 месяца эксперимента выявило достоверное снижение экскреции катиона в леченной галавитом группе относительно как интактных животных, так и животных с моделированием амилоидной нефропатии (таблица 1). Спустя 2 месяца эксперимента экскреция калия с мочой имела тенденцию к достоверному повышению относительно модели амилоидоза и оказалась выше интактного контроля, что, вероятнее всего, было связано с восстановлением фильтрационного заряда катиона и концентрации калия в плазме крови до фоновых значений (таблица 2). Под влиянием галавита экскреция кальция у экспериментальных животных с однократным введением амилоидогена через 1 месяц несколько снижалась относительно амилоидной группы (таблица 1). Через 2 месяца эксперимента в группе с введением галавита экскреция кальция оказалась достоверно выше модели амилоидной нефропатии и превышала фоновые значения, что было обусловлено восстановлением фильтрационного заряда катиона и ростом его концентрации в плазме крови, при этом канальцевая реабсорбция кальция также достигала фоновых значений (таблица 2).
Таблица 1.
Изменения процессов почечной обработки электролитов при моделировании и профилактике амилоидной нефропатии после 1-го месяца эксперимента (М±м)
Условия опыта | Е Na | Е Са | Е K |
мкмоль/час/100г | |||
Фон | 10,68±0,367 | 0,26±0,014 | 7,54±0,381 |
Длительное введение чел. плазмы 1 мес. | 8,63±0,227 *) | 0,30±0,014 *) | 8,85±0,272 *) |
Однократное введение чел. плазмы с АФ 1 мес. | 8,61±0,186 *) | 0,32±0,012 *) | 8,59±0,279 *) |
Длительное введение чел. плазмы и галавита 1 мес. | 9,06 ±0,120 - | 0,22±0,008 **) | 6,95±0,286 **) |
Однократное введение чел. плазмы с АФ и галавита 1 мес. | 8,47 ±0,410 - | 0,20±0,008 *)**) | 6,10±0,279 *)**) |
*)достоверное отличие по сравнению с фоном
**)достоверное отличие по сравнению с введением амилоидогена
Таблица 2.
Изменения процессов почечной обработки электролитов при моделировании и профилактике амилоидной нефропатии после 2-х месяцев эксперимента (М±м)
Условия опыта | Фон | Длительное введение чел. плазмы 2 мес. | Однократное введение чел. плазмы с АФ 2 мес. | Длительное введение чел. плазмы и галавита 2 мес. | Однократное введение чел. плазмы с АФ и галавита 2 мес. | ||
Натрий | Е Na | мкмоль/ час/100г | 10,68±0,367 | 6,62±0,377 *) | 6,54±0,268 *) | 10,76±0,531 **) | 11,71±0,719 **) |
F Na | 2667±31,79 | 1533±21,88 *) | 1635±50,96 *) | 2471±46,43 **) | 2519±27,29 **) | ||
R Na | % | 99,61±0,014 | 99,19±0,023 *) | 99,15±0,027 *) | 99,52±0,026 **) | 99,59±0,034 **) | |
Кальций | Е Са | мкмоль/ час/100г | 0,26±0,014 | 0,19±0,009 *) | 0,20±0,010 *) | 0,31±0,019 **) | 0,34±0,021 **) |
F Са | 35,14±0,419 | 18,80±0,268 *) | 20,52±0,639 *) | 34,78±0,283 **) | 33,21±0,292 **) | ||
R Са | % | 99,30±0,036 | 99,00±0,038 *) | 99,01±0,046 *) | 99,27±0,029 **) | 99,29±0,039 **) | |
Калий | Е К | мкмоль/ час/100г | 10,68±0,367 | 5,68±0,167 *) | 5,21±0,226 *) | 10,89±1,009 **) | 10,02±0,505 **) |
F К | 92,60±1,009 | 68,41±0,977 *) | 70,52±2,197 *) | 90,11±1,091 **) | 91,09±1,016 **) |
*)достоверное отличие по сравнению с фоном
**)достоверное отличие по сравнению с введением амилоидогена
Примечание. АФ – адъювант Фрейнда. E – экскреция электролита, R – реабсорбция электролита, F – фильтрационный заряд электролита
Рис. 2. Динамика показателей ПОЛ и АОЗ при моделировании амилоидоза и его профилактике
Изучение состояния оксидантной и антиоксидантной систем на фоне профилактического применения галавита при одновременном однократном введении амилоидогена выявило, что по истечении 2 месяцев эксперимента имело место достоверное снижение содержания продуктов ПОЛ (концентрации гидроперекисей в крови, содержания малонового диальдегида в эритроцитах) относительно данных амилоидной группы животных, что свидетельствовало об ослаблении интенсивности процесса ПОЛ на фоне активации антиоксидантной системы, поскольку активность каталазы в эритроцитах приближалась к фоновым значениям (рис. 3).
При профилактическом применении галавита на протяжении обоих месяцев эксперимента экскреция белка с мочой достоверно снижалась по истечении 2-х месяцев и даже была несколько ниже фоновых значений (таблица 3).
Таким образом, применение галавита на фоне однократного введения амилоидогена (нативной человеческой плазмы в сочетании с адъювантом Фрейнда) способствовало уменьшению нарушений ионо - и водовыделительной функций почек за счет восстановления канальцевой реабсорбции и скорости клубочковой фильтрации, степени протеинурии, интенсивности процессов ПОЛ.
Таблица 3.
Динамика протеинурии при моделировании амилоидоза и его профилактике
Условия опыта | Стат. показатель | |
M±m | P | |
Фон | 0,98±0,030 | |
Длительное введение чел. плазмы 1 мес. | 1,21±0,069 | 0,001 |
Длительное введение чел. плазмы 2 мес. | 2,80±0,085 | 0,001 |
Однократное введение чел. плазмы с адъювантом Фрейнда 1 мес. | 1,71±0,079 | 0,001 |
Однократное введение чел. плазмы с адъювантом Фрейнда 2 мес. | 2,62±0,043 | 0,001 |
Длительное введение чел. плазмы и галавита 1 мес. | 1,52±0,127 | 0,001 |
Длительное введение чел. плазмы и галавита 2 мес. | 0,72±0,147 | 0,001 |
Однократное введение чел. плазмы с АФ и галавита 1 мес. | 1,59±0,086 | 0,001 |
Однократное введение чел. плазмы с АФ и галавита 2 мес. | 0,73±0,098 | 0,001 |
3. Морфологическое изучение тканей органов. Сравнительный анализ 2-х моделей амилоидоза и эффективности галавита. Микроскопически при окрашивании срезов конго красным отмечались изменения, характерные для изучаемого патологического процесса. При моделировании экспериментального системного амилоидоза в стенках артериол и капилляров клубочков, в базальной мембране канальцев и чашечно-лоханочной системе почек определялись амилоидпозитивные структуры. Накопление амилоида отмечалось также в селезенке и в печени.
Рис. 3. Накопление амилоида в базальной мембране клубочков и канальцев почек при однократном введении равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда. Выраженная паренхиматозная дистрофия главных отделов нефрона. Окраска конго красным (х400).
Применение галавита у экспериментальных животных на протяжении 2-х месяцев эксперимента способствовало снижению степени выраженности изменений в исследуемых органах и тканях. При микроскопии в мозговом и корковом слоях почек отмечалось некоторое снижение конгофилии стромально-сосудистых структур. Наблюдалось уменьшение гиперемии и отека интерстиция, плазматического пропитывания, сопровождающееся восстановлением гистоархитектоники и уменьшением признаков дистрофии в ткани почек.
Рис. 4. Снижение конгофилии базальных мембран канальцев и клубочков под действием галавита при моделировании амилоидоза у сирийских хомяков. Окраска конго красным (х400).
Сравнительный анализ данных показал, что в ходе моделирования нефропатического амилоидоза более выраженные функциональные и морфологические нарушения выявлялись при модели амилоидоза, полученной методом однократного введения чужеродного белка в смеси с адъювантом Фрейнда, что, возможно, обусловлено более выраженной антигенной стимуляцией. А вот описанные положительные эффекты галавита повторяют друг друга в названных двух моделях.
Таким образом, введение нативной человеческой плазмы длительно, а также однократно в смеси с адъювантом Фрейнда у хомяков сопровождается развитием системного амилоидоза с преимущественным поражением почек, селезенки, печени. Развившийся экспериментальный амилоидоз приводит к протеинурии, снижению основных функциональных показателей почек (водо - и электролитовыделительной функций), интенсификации процесса ПОЛ.
Через свои основные механизмы действия препарат галавит может уменьшать проявления амилоидной нефропатии (как это показано в наших опытах), приводя к значительному восстановлению ионо - и водовыделительной функций почек и снижению степени протеинурии, а также ослаблению интенсивности процесса ПОЛ. Применение галавита способствует улучшению гистологической картины амилоидоза в исследуемых органах и тканях.
Примечание: результаты собственных исследований обозначены сплошной линией, пунктирной – предполагаемые данные.
Рис. 5. Патогенетическая схема механизмов развития моделей экспериментального генерализованного амилоидоза нефропатического типа и влияние галавита
Результаты проведенных исследований обобщены в следующей патогенетической схеме (рис. 5), из которой видно, что моделирование амилоидоза как путем длительного введения амилоидогена, так и однократного способствует развитию оксидативного стресса, возможно как одного из пусковых механизмов повреждения и накоплению амилоида в стромально-сосудистых структурах. Последнее происходит, вероятнее всего, исходя из современной концепции развития вторичного АА-амилоидоза, за счет увеличения синтеза острофазного белка-предшественника А-амилоида (SAA) вследствие постоянно повышенного образования провоспалительных цитокинов. Все это вызывает функциональные нарушения, проявляющиеся снижением скорости клубочковой фильтрации, снижением диуреза, нарушением электролитного баланса, протеинурией.
Исходя из вышеописанного, можно предположить, что галавит за счет своих основных механизмов действия: ингибирования избыточного синтеза гиперактивированными макрофагами провоспалительных цитокинов, а также антиоксидантного эффекта, оказывает профилактирующее действие на формирование морфологических и функциональных нарушений при моделировании генерализованного амилоидоза нефропатического типа.
Выводы
1. Длительное подкожное введение нативной человеческой плазмы сирийским хомякам в течение 2-х месяцев вызывает развитие экспериментального амилоидоза с накоплением амилоида преимущественно в структурах почек, селезенки, стенках кровеносных сосудов. Экспериментальная амилоидная нефропатия у животных проявляется снижением 6-часового спонтанного диуреза на фоне уменьшения скорости клубочковой фильтрации и экскреции электролитов, выраженной протеинурией, развитием оксидативного стресса и угнетением ферментативного звена антиоксидантной системы.
2. Однократное введение нативной человеческой плазмы в равнодолевой смеси с адъювантом Фрейнда сирийским хомякам через 1 и 2 месяцев эксперимента сопровождается развитием системного амилоидоза с выраженными морфофункциональными признаками амилоидной нефропатии. Наблюдаемые изменения подобны проявлениям модели с длительным введением амилоидогена.
3. Сравнительный анализ функциональных и морфологических признаков двух созданных моделей амилоидоза у сирийских хомяков выявил, что однократное введение амилоидогена (равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы в сочетании с адъювантом Фрейнда) проявляется более выраженными морфологическими изменениями, а также функциональными нарушениями.
4. Введение галавита в дозе 0,28 мг/кг через день в течение 2-х месяцев одновременно с подкожным введением нативной человеческой плазмы снижает развитие гистоструктурных признаков амилоидоза, уменьшает выраженность протеинурии и степени нарушений ионо - и водовыделительной функции почек и способствует ослаблению интенсификации процессов перекисного окисления липидов, развившихся на фоне экспериментальной амилоидной нефропатии, путем активации антиоксидантной системы.
5. Длительное (в течение 2-х месяцев) подкожное введение галавита в дозе 0,28 мг/кг через день на фоне однократного введения амилоидогена (равнодолевой смеси нативной человеческой плазмы и адъюванта Фрейнда) уменьшает формирование морфологических признаков амилоидоза. В результате уменьшаются выраженность протеинурии, нарушения водовыделительной и электролитовыделительной функции почек, ослабляется усиление процессов перекисного окисления липидов при активации антиоксидантной защиты.
6. Сравнительный анализ эффективности применения галавита для профилактики развития двух моделей амилоидоза выявляет полное сходство.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. , , Козырев модель экспериментального амилоидоза // Кубанский научный медицинский вестник.- 2011. – №2 (125). – С. 12-15.
2. , , Козырев -морфологическая характеристика экспериментального системного амилоидоза нефропатического типа. // Вестник новых медицинских технологийТ. XVIII, № 2. - С. 122-133.
3. , , Козырев галавита на функционально-морфологическое состояние почек, перекисное окисление липидов и антиоксидантную систему при нефропатическом типе генерализованного амилоидоза // Кубанский научный медицинский вестник.- 2012. – № 3 (132). – С. 30-36.
4. , , Козырев характеристика экспериментального амилоидоза у золотистых сирийских хомяков. Влияние мелаксена // Вестник новых медицинских технологий. – 2012. – Т. XIX, № 3. – С. 151-154.
5. Беликова модель экспериментального генерализованного амилоида нефропатического типа // «Молодые ученые медицине»: Материалы докладов десятой научной конференции молодых ученых. – Владикавказ, 2011 г. - С. 8-10.
6. Патент на изобретение № 000 Российская Федерация. (51) МПК G09В23/28 (2006.01). Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных / , , ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ. - Заявка № /14, 13.11.2010; опубл. 27.03.2012 // Бюл.- 2012. - № 9.
7. Патент на изобретение № 000 Российская Федерация. (51) МПК G09В23/28 (2006.01). Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных / , , ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. - Заявка № /14, 30.03.2011; опубл. 20.01.2013 // Бюл. – 2013. - № 2.
8. Патент на изобретение № 000 Российская Федерация. (51) МПК G09В23/28 (2006.01). Способ профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных / , , ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ. - Заявка № /14, 29.03.2011; опубл. 20.01.2013 // Бюл. – 2013 – № 2.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ:
АОЗ – антиоксидантная защита;
ПОЛ – перекисное окисление липидов;
АФ – адъювант Фрейнда;
СКФ – скорость клубочковой фильтрации;
ТБК – тиобарбитуровая кислота.
Информационно-технический отдел
ГБОУ ВПО СОГМА Минздрава России
Подписано в печать 21.05.2013 г. Тираж 100 экз.
Формат издания 60х90 усл. печ. л.1,0
Заказ № 25
