Массовый скрининг новорожденных на наследственные болезни обмена как часть системы медико-генетической помощи населению (стр. 1 )

На правах рукописи

МАТУЛЕВИЧ

Светлана Алексеевна

МАССОВЫЙ СКРИНИНГ НОВОРОЖДЕННЫХ НА НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ ОБМЕНА КАК ЧАСТЬ СИСТЕМЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПОМОЩИ НАСЕЛЕНИЮ

03.00.15 – генетика

Автореферат

на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Медико-генетический научный центр РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация: ГУ НИИ медицинской генетики Томского

научного центра СО РАМН, г. Томск

Защита состоится «______»___________________ 2009 г. в _______часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01. при ГУ МГНЦ РАМН Москва, ул. Москворечье,.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения «Медико-генетический научный центр» РАМН Москва, ул. Москворечье,.

Автореферат разослан «______»___________________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских

диссертаций, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Наследственные болезни обмена веществ (НБО) занимают заметное место в наследственной патологии человека, встречаются с разной частотой во всех популяциях. НБО, как правило, имеют тяжелые и во многих случаях фатальные проявления. Для ряда наследственных болезней обмена разработаны методы лечения, эффективные при их ранней диагностике.

Массовое обследование новорожденных (неонатальный скрининг) на НБО является основой профилактики наследственных болезней в популяциях, поскольку, позволяет выявлять заболевания на доклинической стадии, своевременно начинать лечение, формировать контингенты, требующие систематического медико-генетического консультирования, а также способствует обнаружению гетерозиготного носительства мутантного гена и проведению пренатальной диагностики.

История скрининга новорожденных в мире насчитывает несколько десятилетий. За это время накоплен достаточный опыт и сформулированы основные принципы скринирующих программ, касающиеся выбора нозологий для исследования, требований к лабораторной диагностике (методам тестирования, системе контроля качества и т. д.), соблюдению этических норм и т. д. Вместе с тем, следует подчеркнуть, что эти принципы по-разному реализуются в разных странах в зависимости от принятой системы организации медицинской помощи. Это требует разработки научных основ неонатального скрининга применительно к конкретным условиям с учетом основных принципов, принятых международным сообществом.

Программа неонатального скрининга обязательно включает в себя следующие этапы: 1) взятие биологического материала для исследования у всех новорожденных и доставка материала в диагностическую лабораторию; 2) лабораторная просеивающая диагностика; 3) уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами при просеивании; 4) лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения; 5) медико-генетическое консультирование семьи.

Программы массового обследования на наследственные болезни, поддающиеся профилактическому лечению, могут учреждаться только в рамках федерального или регионального здравоохранения. Они требуют организации специального звена в структуре здравоохранения и немалых экономических затрат, которые в общегосударственном масштабе компенсируются за счет уменьшения числа инвалидов с детства и снижения детской смертности. Многочисленные исследования, проведенные в разных странах ( и соавт., 2002; и соавт., 2006; Laberge J., 1983; Hannon H., Therrell B., 1991), показали, что по затратам на просеивающие программы и экономической эффективности от их применения (сохранение здоровья леченых индивидов) указанные программы дают государству 5-10-кратную экономическую выгоду.

Существуют трудности в оказании эффективной медико-генетической помощи населению в связи с тем, что в организации Скрининга остается много нерешенных вопросов как теоретического, так и прикладного характера. Прежде всего, недостаточно разработаны научные основы организации массового обследования новорожденных на НБО, принципы диспансерного наблюдения, вопросы преемственности в деятельности медико-генетических и других лечебно-профилактических учреждений. Требуют разрешения вопросы унификации обследования больных клиническими и лабораторными методами, создания региональных регистров НБО, организации лабораторий молекулярной диагностики, выявления факторов, влияющих на ложноположительные и ложноотрицательные результаты скрининга. Разработка подобных вопросов может стать основой для оптимизации подходов к осуществлению эффективной медико-генетической помощи населению.

Проблема ранней диагностики, превентивного лечения и профилактики галактоземии, адреногенитального синдрома и муковисцидоза, включенных в Программу скрининга только в 2006 году, в системе здравоохранения нашей страны осталась не до конца решенной, а популяционно-генетические аспекты данных заболеваний изучены лишь в отдельных регионах Российской Федерации, хотя разработка вопросов генетической эпидемиологии НБО принципиально важна как с практической, так и с теоретической точек зрения.

Цель исследования: разработка стратегических, организационных и методических принципов массового обследования новорожденных на наследственные болезни обмена, позволяющих осуществлять эффективную помощь населению (на примере крупного многонационального региона России – Краснодарского края).

Задачи исследования:

1.  Разработать мероприятия и регламентирующую документацию для организации и проведения неонатального скрининга на НБО. Оценить вклад деятельности региональных органов здравоохранения в организацию скрининга на НБО.

2.  Оценить результаты неонатального скрининга на ФКУ и врожденный гипотиреоз за гг.

3.  Разработать мероприятия и оценить их эффективность по внедрению Программы неонатального скрининга на муковисцидоз, галактоземию, адреногенитальный синдром, выполняемой в рамках национального проекта «Здоровье».

4.  Определить частоту муковисцидоза, галактоземии, АГС среди новорожденных Краснодарского края по данным неонатального скрининга.

5.  Провести ДНК-диагностику и верифицировать генные мутации у больных фенилкетонурией и муковисцидозом, выявленных при проведении массового обследования новорожденных.

6.  Разработать и оценить эффективность внедрения компьютерной программы для поддержки неонатального скрининга на НБО.

7.  Создать краевой регистр наследственных болезней обмена.

Новизна результатов исследования

Впервые в Краснодарском крае на большой выборке (около 1 млн. новорожденных) определены частоты фенилкетонурии и врожденного гипотиреоза. Определены территориальная неравномерность гетерозиготного носительства и разнообразие мутаций в гене фенилаланингидроксилазы (ФАГ).

Впервые проведен сравнительный анализ клинической и биохимической диагностики врожденного гипотиреоза до и после внедрения неонатального скрининга, показавший, что лишь массовый биохимический скрининг позволяет поставить диагноз в первые дни жизни новорожденных. Установлена корреляция частоты врожденного гипотиреоза с уровнем неонатального ТТГ.

По данным неонатального скрининга определены ориентировочные частоты муковисцидоза, галактоземии и адреногенитального синдрома. Впервые в рамках неонатального скрининга проведено молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене CFTR с использованием наборов «CF-9» и «CF-5», разработанных в лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН. Выявлено 4 мутации из 14 изучаемых. Определена информативность молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза по изученному спектру мутаций и частота мажорной мутации delF508.

Впервые установлено влияние на повышение уровня ИРТ в крови новорожденных четырех факторов: анемии беременных, желтухи и гипоксии новорожденных, инфузионной терапии.

Разработан программный комплекс «Неоскрин», состоящий из двух отдельных программ. Программа «Регистрация новорожденных в родильном доме» предназначена для ввода информации о родившихся, передачи данных о них в МГК на электронном носителе, формирования территориального регистра новорожденных, ежедневной оценки качества проведения скрининга, формирования отчетов. Программа «Скрининг новорожденных», установленная в МГК, позволяет объединить и проанализировать всю информацию о новорожденных, поступающую из территорий края, откорректировать пороговые уровни исследуемых метаболитов для обследуемой популяции.

Создан краевой регистр наследственных заболеваний обмена веществ, позволяющий прогнозировать динамику генетического груза в популяции и разрабатывать необходимые медико-социальные мероприятия.

Практическая значимость

Впервые проведен анализ мероприятий по организации неонатального скрининга на НБО в крупном регионе России (Краснодарском крае). Показана эффективность функционирования лаборатории массового скрининга новорожденных в структуре медико-генетической консультации.

Доказана эффективность внедрения в практику здравоохранения компьютерных технологий, позволяющих ускорить и сделать более объективным процесс организации неонатального скрининга.

Разработан и внедрен программный комплекс «Неоскрин», позволяющий консолидировать данные, получаемые из регионов в единую систему данных лаборатории неонатального скрининга МГК, автоматизировать действия по заполнению и обновлению содержимого разделов программы; создать краевой и региональные регистры новорожденных, добиться 100% регистрации родившихся детей; оптимизировать работу лаборатории неонатального скрининга; использовать электронную почту для оперативной связи с ЛПУ края; получать достоверные статистические и отчетные данные о функционировании скрининга. Впервые программа по регистрации новорожденных была интегрирована во все родильные дома края. Принцип программного комплекса «Неоскрин», основанный на взаимодействии ЛПУ и лаборатории, осуществляющей неонатальный скрининг в крупном регионе страны, может быть использован для создания единой системы организации неонатального скрининга в федеральном округе, возможно и на уровне всей страны.

Создание краевого регистра наследственных заболеваний обмена веществ позволит определить объем медицинской помощи, формировать поток семей для медико-генетического консультирования и разрабатывать необходимые медико-социальные мероприятия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.  Выявлены общие организационные закономерности, позволившие добиться стабильно высокого процента обследования новорожденных и благодаря раннему, своевременному началу лечения предотвратить или значительно снизить клинические проявления диагностируемых наследственных болезней обмена.

2.  Успешная организация неонатального скрининга возможна только при соблюдении принципа централизации и единого алгоритма скрининга на всей территории страны, систематическом анализе качества проведения скрининга, директивной поддержке субъекта Российской Федерации.

3.  Установлены частоты фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, муковисцидоза, адреногенитального синдрома и галактоземии среди новорожденных в Краснодарском крае.

4.  Определена территориальная неравномерность гетерозиготного носительства мутаций гена ФАГ в популяции Краснодарского края.

5.  Разработан компьютеризированный программный комплекс, предусматривающий решение задач накопления персонифицированных данных о каждом новорожденном, что позволяет осуществлять высокоэффективный контроль за качеством проведения Скрининга и проводить статистический анализ полученной информации.

6.  Создан алгоритм неонатального скрининга на НБО на территории Краснодарского края.

7.  Создание регионального регистра наследственных болезней обмена позволяет решать задачи сбора эпидемиологической информации о нозологической структуре болезней, генетического мониторирования населения, диспансеризации семей с наследственной патологией, прогнозирования и профилактики наследственной патологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на Республиканском совещании «Принципы организации и методические основы профилактики инвалидизирующих наследственных болезней» (Москва, 1996), Региональной научно-практической конференции «Медицина будущего» (Сочи, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003), Всероссийской научной конференции «Медико-генетическая оценка пищевых продуктов» (Москва, 2003), Региональной научно-практической конференции Южного федерального округа «Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты» (Ростов н/Д, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Скрининг врожденного гипотиреоза в РФ. Опыт, проблемы, пути оптимизации» (Москва, 2005), V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005), VIII научно-практической конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), XII Конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2008), Региональном интерактивном семинаре по избранным вопросам тиреоидологии (Сочи, 2008), VI региональной научно-практической конференции Южного федерального округа «Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты. Генетический скрининг» (Сочи, 2008), заседании межведомственной рабочей группы Совета при президенте Российской федерации по реализации приоритетных национальных проектов и демографической политике (Москва, 2008), научно-практической конференции «Современные аспекты диагностики, наблюдения и нутритивной поддержки больных с врожденными метаболическими заболеваниями» (Римини, Италия, 2008), SSIEM ANNUAL SYMPOSIUM (Лиссабон, Португалия, 2008), на краевых научно-практических конференциях акушеров-гинекологов и педиатров (Краснодар, ).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ГУ МГНЦ РАМН 3 декабря 2008 года.

Внедрение в практику здравоохранения

Материалы диссертации внедрены в работу Кубанской межрегиональной медико-генетической консультации, Адыгейского республиканского клинического перинатального центра, родовспомогательных и детских лечебных учреждений при проведении неонатального скрининга на наследственные болезни обмена, а также включены в учебный процесс Кубанского государственного медицинского университета при обучении студентов и слушателей факультетов последипломной подготовки по специальностям: педиатрия, неонатология, гастроэнтерология, эндокринология, неврология, генетика.

Результаты проведенных исследований легли в основу 7 приказов департамента здравоохранения Краснодарского края, направленных на оптимизацию неонатального скрининга. Проведены семинарские занятия и научно-практические конференции с врачами лечебно-профилактических учреждений края, выпущено 5 методических рекомендаций для врачей.

В КММГК и во всех родовспомогательных учреждениях Краснодарского края и Республики Адыгея внедрен разработанный алгоритм неонатального скрининга на НБО с использованием программного комплекса «Неоскрин».

Личное участие диссертанта. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 42 научные работы, из них 13 – в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, издано 5 методических рекомендации для врачей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 217 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав с описанием методики и результатов исследова­ния, заключения, выводов, библиографии (104 источников на русском и 137 на иностранном языках) и приложений. Работа содержит 30 рисунков и 28 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для реализации поставленной цели было проведено многоплановое комплексное исследование, в котором были использованы клинические, биохимические, молекулярно-генетические, генеалогические, психологические, статистические методы.

Нами обобщенны данные о группах пациентов, которые послужили информационной базой исследования:

·  1 061 108 новорожденных, родившихся с 1.01.1987г. по 31.12.2007г., обследованных на ФКУ;

·  новорожденных, родившихся с 1.01.1994г. по 31.12.2007г., обследованных на ВГ;

·  новорожденных, родившихся с 1.07.2006г. по 30.06.2008г., обследованных на МВ, АГС;

·  116 041 новорожденных, родившихся с 01.10.2006г. по 30.09.2008г., обследованных на галактоземию;

·  выявленные при неонатальном скрининге дети с наследственными болезнями обмена (ФКУ -165, ВГ - 111, МВ -10, АГС-15, галактоземия -6);

·  20 000 новорожденных, родившихся с 1.03.08 по 31.05.08, у которых при скрининге на НБО отмечались нормальные значения ФА, ТТГ, 17-ОНР, ИРТ и галактозы, послужили группой контроля. Сведения о новорожденных получены из программного комплекса «Неоскрин».

Программа неонатального скрининга обязательно включает в себя следующие этапы: 1) взятие биологического материала для исследования у всех новорожденных и доставка материала в диагностическую лабораторию; 2) лабораторная просеивающая диагностика; 3) уточняющая диагностика всех случаев с положительными результатами при просеивании; 4) лечение больных и их диспансеризация с контролем за ходом лечения; 5) медико-генетическое консультирование семьи.

Материалом для исследования служила капиллярная кровь, взятая в родильном доме из пальца или пятки новорожденного на 4-5-й день жизни на бланки фильтровальной бумаги марки Schleicher & Schuell 2992. Высушенные образцы крови отсылались в лабораторию КММГК письмом или передавались с нарочным. Определение метаболитов проводилось в качественно взятых образцах крови. При повышенном уровне исследуемых метаболитов проводилось повторное исследование в дублях в образцах крови поступивших тест-бланков. Если среднее число 3-х результатов было выше порогового уровня, проводился забор крови для повторного исследования (ретест). При положительном ретесте дети срочно вызывались в МГК для проведения подтверждающей диагностики. Накопление и обработка данных проводилась с использованием разработанной в КММГК компьютерной программы «Скрининг новорожденных».

С целью диагностики фенилкетонурии определяли уровень фенилаланина (ФА). До 1992г. использовался полуколичественный микробиологический тест Гатри, с 1992г. - количественный флюориметрический метод. Пороговым значением считали уровень ФА более 2,0мг/дл. Если при проведении подтверждающей диагностики уровень ФА определялся более 7,9мг/дл, диагностировалась Фенилкетонурия и назначалась терапия. При ФА от 2,1 до 7,9мг/дл ставился диагноз «Доброкачественная гиперфенилаланинемия».

С целью диагностики врожденного гипотиреоза определяли уровень тиреотропного гормона (ТТГ) методом иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. Пороговым значением для выявления ВГ считали уровень ТТГ≥20 мЕ/л у новорожденных 4-5 дней жизни, ТТГ≥5 мЕ/л у новорожденных 7-14 дней жизни. Подтверждающая диагностика проводилась методом иммунофлюоресцентного анализа в сыворотке крови путем определения ТТГ, свободного тироксина (св. Т4).

С целью диагностики муковисцидоза определяли уровень иммунореактивного трипсина (ИРТ) иммунофлюоресцентным методом. При положительном результате скрининга (ИРТ >70 нг/мл) проводили повторное определение ИРТ в образцах крови, собранных на 21-28-й день жизни. При повторно высоком уровне ИРТ (>40 нг/мл) проводили потовую пробу с помощью системы для электрофореза и сбора пота Macroduct корпорации “Vescor”. Измерялась “эквивалентная” концентрация хлорида натрия в потовой жидкости. За норму принимались результаты 0-60 ммоль/л, показаммоль/л расценивались как пограничные, 80 ммоль/л и выше считались позитивными для муковисцидоза. При пограничном и позитивном результате потовой пробы проводили ДНК-диагностику.

С целью диагностики адреногенитального синдрома определяли уровень 17α-оксигидропрогестерона (17-ОНР) методом твердофазного иммунофлюоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции. За пороговый уровень у доношенных новорожденных (срок гестации больше 36 недель, вес больше 2,5кг) принимали значения 17-ОНР 30,0 nmol/l, у недоношенных при сроке гестации 33-36 недель (вес меньше 2,5кг) – 60,0 nmol/l, при сроке гестации 23-32 недели - 100,0 nmol/l.

Подтверждающая диагностика проводилась путем ультразвукового исследования надпочечников и определения в крови уровня электролитов (калий, натрий), кортизола, 17-ОНР.

С целью диагностики галактоземии определяли уровень общей галактозы (Гал) (галактоза + галактоза-1-фосфаты) флюоресцентным методом. Пороговым значением для выявления галактоземии считали уровень Гал >7,1 мг/дл.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах, с последующей амплификацией, анализом расщепления фрагментов ДНК ферментами рестрикции (лат., детекцией на электрофорезе фрагментов ДНК в полиакриламидных гелях.

Для определения мутаций использовали наборы, разработанные в ГУ МГНЦ РАМН:

«PCU-8» - для определения 8 частых мутаций в гене ФАГ (I65T, IVS10nt546, IVS12nt1, R261Q, R252W, R408W, R158Q, P281L);

«CF-9» и «CF-5» - для диагностики 9 и 5 мутаций соответственно в гене CFTR (del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X; W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbc->T).

Полученные результаты документировали с помощью программного обеспечения «Gel Imager» (Россия).

Генетико-эпидемиологические исследования проводились с использованием данных неонатального скрининга за период гг. В ходе работы созданы компьютерные базы данных семей: с ФКУ (230 случаев ФКУ из 205 семей), с ВГ (170 случаев ВГ из 168 семей), с АГС (15 семей), МВ (10 семей), ГАЛ (6 семей). Полученные данные сравнивали с официальными демографическими данными по Краснодарскому краю (Основные итоги Всероссийской переписи населения 2002г. по Краснодарскому краю, 2003г.).

Были проанализированы амбулаторные медико-генетические карты, разработанные нами анкеты на семьи с больными НБО.

Частоту гетерозиготных носителей фенилкетонурии в популяции рассчитывали на основании закона Харди-Вайнберга по формуле:

p2+2pq+q2=1,

где q - частота нормального гена,

p - частота мутантного аллеля.

Изучение интеллектуального уровня детей с ФКУ дошкольного возраста проводилось рисуночным тестом Гудиноф-Харриса, школьного возраста - с помощью компьютерной программы “Тест”, которая является адаптированным вариантом теста Д. Векслера. Определяли коэффициент интеллекта ОИП (общий интеллектуальный потенциал). За минимальное значение нормы принимали коэффициент ОИП =70. При подозрении на снижение интеллекта (ОИП=70 и ниже) ребенок консультировался детским психиатром.

Для диагностики психического развития детей с ФКУ применялись методы наблюдения и стандартные патопсихологические методики, адаптированные для каждого возрастного интервала.

Для оценки физического развития детей определяли массо-ростовой индекс (МРИ) по формуле:

МРИ =

М х 100 P

где М - отношение фактической массы тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста,

P - отношение фактической длины тела к величине 50-го перцентиля этого показателя для данного возраста.

За норму принимали МРИ от 90 до 99. При МРИ=89 и ниже диагностировали дефицит массы тела, при МРИ=100 и более - избыточную массу тела.

Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики (, 1990; , 1996) с определением критерия Стьюдента, средней арифметической (М), стандартной ошибки (±m) и показателя достоверности различий (р).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Организация неонатального скрининга на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае

Началом неонатального скрининга на НБО принято считать 1962г., когда в штате Массачусетс США было организовано тестирование новорожденных на фенилкетонурию. Скрининг широко распространился в мире. В рамках многих программ было начато тестирование и на другие наследственные дефекты. В настоящее время программы неонатального скрининга охватывают от 8 до 50 наследственных нарушений обмена.

В России массовое обследование новорожденных на ФКУ начало проводиться с 1985г., на врожденный гипотиреоз с 1993г. С 2006г. внедрен скрининг на муковисцидоз, адреногенитальный синдром и галактоземию.

В Краснодарском крае массовое обследование новорожденных на НБО (ФКУ) проводится с 1987г. С 1994г. новорожденные обследовались на два заболевания (ФКУ, врожденный гипотиреоз), с 2006г. – на 5 (ФКУ, ВГ, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, галактоземию). Уровень охвата скринингом новорожденных края с 1997г. стабильно превышает 99,0% (таблица 1).

Таблица 1 Результаты скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена в Краснодарском крае за период с гг.
Наследственное заболевание обмена веществ	Обследовано новорожден-ных	Выявлено больных	Частота заболевания в КК	Частота заболевания в РФ (, 2008)
фенилкетонурия	1 061 ,4%)	111	1 : 8 376	1 : 7 697
врожденный гипотиреоз	680 ,0%)	161	1 : 4 228	1 : 4 132
муковисцидоз	,7%)	10	1 :	1 :
адреногенитальный синдром	,7%)	15	1 : 7 617	1 : 8 662
галактоземия	,2%)	6	1 :	1 :

В организации неонатального скрининга в крае можно выделить несколько основных этапов, связанных с развитием медико-генетической службы: