Новые технологии иммунодиагностики и механизмы иммунных нарушений при урогенитальных инфекциях у женщин репродуктивного возраста (стр. 2 )

Таблица 1. Предлагаемые оригинальные праймеры для генотипирования штаммов Ch. trachomatis

Генотипы	Олигонуклеотидные праймеры	Размер продукта
Группа генотипов B (генотипы: B, Ba, D, Da, E, L1, L2, L2a)	BGr1 f 5'-GCTTAATCAATCTGGCTGTTGA-3' BGr1 r 5'-TCCAGACTTGTGGATAGTAAAC-3'	191 п. н.
Группа генотипов С (генотипы: A, C, H, I, Ja, J, K и L3)	CGr f 5'-AACTAAGTGGGCTTATTAGGAA-3' CGr r 5'-TCAAGTAGAGAGCTAGACCA-3'	107 п. н.
промежуточная группа (генотипы: F, G, Ga)	FI 5'-CTGGGATGGAACTGTATACA-3' RI 5'-TACAACTCAGGGTAGGTCAA-3'	274 п. н.
Генотип C	Comp f 5'-AAGGAAGTGTGGGATCTGACG-3' Comp r 5'-AAATATACAATGATTAGCACC-3'	221 п. н.
Генотип Е	Eomp f 5'-AGACGGATACCGCCTTATCTTG-3' Eomp r 5'-CTGGCTTGCCACTCAGGCTAAT-3'	265 п. н.
Генотип J	Jomp f 5'-ATATTTTGCCTAAGACTGCT-3' Jomp r 5'-TTTAGGGTTAGATAGAGAAT-3'	152 п. н.
Генотип Ja	Jaomp f 5'-TAGTGTCGGCGACGTAGCAG-3' Jaomp r 5'-TCCTAGATATTTAATGCCAT-3'	135 п. н.
Генотип H	Fh 5'-ATCTTCTGAGTATAATACAGC-3' Rh 5'-ACGTTACGTTTAAATTGAGCA-3'	177 п. н.
Генотип F	Ff 5'-ACGAAACGTGCTGCAAATA-3' Rf 5'- TAGCCAATCATTGTAAACA-3'	321 п. н.
Генотип D	Domp f 5'-ATAATGAGAATCTAAAGACG-3' Domp r 5'-TAGAATGAGCATATTGGCAA-3'	174 п. н.
Генотип K	Komp f 5'-TGTTCTTAACACAGCTTTGGA-3' Komp r 5'-AGGTATAGATTGAGCGTATTGG-3'	150 п. н.
Генотип G	Gomp f 5'-AGAGTAGTCGCAGCGAAC-3' Gomp r 5'-ACTGTAACGGCGTATGTG-3'	146 п. н.
Генотип A	Aomp f 5'-AATACAGTATTCTGGCTTAGAT-3' Aomp r 5'-TGACTGAATGCAGGGTTGGGA-3'	57 п. н.
Генотип B	Bomp f 5'-AGTTCGAGAGTATCTTTGATGTT-3' Bomp r 5'-TCTGCGCTAGTTATCATTATCG-3'	75 п. н.

Ch. trachomatis осуществляли с помощью ПЦР, применяя специфические сконструированные оригинальные олигонуклеотидные праймеры, ориентированные к вариабельным участкам VS1–VS4 гена ompA Ch. trachomatis (табл. 1). Первоначально проводили амплификацию с использованием специфических праймеров к группам генотипов, далее с использованием специфических праймеров к определенному генотипу группы.

Анализ антибиотикорезистентности штаммов Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae проводили с помощью ПЦР с использованием подобранных оригинальных праймеров с целью выявления генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (erm): Tet-f: 5'-AGYTTCCACCGAAYTCCTTTC-3' и Tet-r: 5'-ATACACCGAGCAGGGATTTC-3' (размер продукта амплификации 470 пар нуклеотидов); Erm-f: 5'-AAGCCAYTGCGTCTGACATC-3' и Erm-r: 5'-TGGCGTGTTTCATTGCTTGA-3' (размер продукта амплификации 300 пар нуклеотидов).

Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании. Конструирование олигонуклеотидных праймеров проводили с применением биоинформационного анализа комплексом компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www. /site/us/en/home. html), DNASTAR, BLAST (http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi/), и данные электронной базы NCBI Gen Bank (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/).

Цитологический метод (диагностика хламидиоза)

Забранный материал из Цк, Вл, Ур, задней стенки глотки в виде мазков-соскобов наносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали на воздухе и фиксировали не менее 15-ти минут в 96º этиловом спирте для последующей окраски и микроскопии. Окраску мазков проводили по Романовскому-Гимзе и раствором Люголя, согласно общепринятой методике (, 2004). Учет результатов осуществляли на световом микроскопе «Микмед 5» при увеличениях ×100, ×400, ×1000. Проводили также окрашивание меченными моноклональными антителами (тест-система CeLLabs, Австралия) для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae в реакции ПИФ (для Ch. trachomatis) и НИФ (для Chl. pneumoniae). Учет результатов осуществляли на люминесцентном микроскопе «Micros» (Австрия) при увеличении ×600. Хламидии в препаратах выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Мазки-соскобы также исследовали ПЦР-методом.

Серологический метод (диагностика хламидийной инфекции)

Выявление Ат к Ch. trachomatis осуществляли в сыворотке крови человека и обезьян с помощью ИФА ( и др., 2008; , 2002). Выявление Ат иммуноглобулинов (Ig) классов IgA и IgG к Ch. trachomatis проводилось на тест-системах Ch. trachomatis-IgA-pELISA medac и Ch. trachomatis-IgG-pELISA medac (Германия). Положительным результатом считали содержание IgA-Ат ≥1:50, IgG-Ат ≥1:50. Выявление Ат к белку теплового шока (БТШ) проводилось с использованием иммуноферментного тест-набора для определения IgG-Ат к хламидийным белкам теплового шока 60 cHSP60-IgG-ELISA medac (Германия). Положительный результат оценивался при содержании IgG-Ат ≥ 1:50. Постановку реакций проводили в соответствии с инструкциями по применению, прилагаемых производителем.

Культуральный метод (диагностика хламидиоза)

Соскобным материалом, полученным из УГТ, инокулировали суточную культуру клеток McCoy, выращенную на покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшет (, 2002; , 2004). Центрифугирование после инокуляции проводили при 1000 об/мин в течение 1 часа. Контроль развития хламидийной инфекции осуществляли путем микроскопирования клеток в инвертированном микроскопе «ЛОМО» (Россия). Покровные стекла окрашивали по Романовскому-Гимзе, раствором Люголя или меченными моноклональными антителами для выявления антигенов хламидий в реакции ПИФ и непрямой иммунофлуресценции НИФ (тест-система CeLLabs, Австралия). Титрование хламидий осуществляли стандартным методом по цитопатическому действию (, 2008). Детекцию возбудителя в инфицированных клетках культуры проводили также с помощью ПЦР.

Иммунологические методы исследования

Забор ЦС проводили с помощью стерильного урологического зонда. Зонд немедленно погружали в пробирку типа «Эппендорф», содержащую 0,5 мл физиологического раствора. К каждому образцу после взвешивания добавляли равное весовое количество физиологического раствора, после чего смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут на шейкере. Образцы хранили при температуре минус 50°С не более трёх месяцев. Определение общего белка проводили согласно инструкции к «Набору по определению общего белка в моче ФС» ("Диакон Диагностика", г. Москва).

Смыв со стенок влагалища проводили следующим образом: 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина вливали во влагалище, оставляли на 10 минут, затем проводили аспирацию всей жидкости из влагалища. Полученный секрет тщательно перемешивали и затем помещали в пробирки типа «Эппендорф». Образцы хранили при температуре минус 50 °С.

Определение иммуноглобулинов в ЦС и смыве из Вл женщин

Иммунологическое исследование включало определение концентрации в ЦС IgG, IgМ, IgА, sIgА и свободного sc методом радиальной иммунодиффузии РИД ( И др., 1987).

Определение цитокинов в ЦС женщин

Содержание в слизи Цк IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α, ГМ-КСФ цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на двух лучевом лазерном автоматизированном анализаторе ("Bio-plex Protein Assay System", Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 10-Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Статистическая обработка полученных данных

Математическую обработку полученных данных проводили в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стьюдента, метода c2, коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs ≥0,7 связь считали сильной; при 0,5≤rs<0,7 связь являлась средней; при rs <0,5 связь считали слабой; при rs=0 – линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.

Морфологический, культуральный, серологический, микробиологический, иммуноцитологический, молекулярно-генетические методы исследования проводились на лабораторной базе ФГУН МНИИЭМ им. Роспотребнадзора. Молекулярно-генетическое типирование штаммов хламидий проводилось на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск, Московской области).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследованием на наличие уреаплазм выявлен высокий титр возбудителя – > 104 КОЕ/мл – у 100% больных. Установлены у 6 больных уреаплазменная моноинфекция и у 44 больных – сочетанный характер инфицирования. При микст-инфекциях наблюдалось образование 2-7-компонентных ассоциаций патогенных агентов.

Таблица 2. Нарушение микробиоценоза влагалища в группе больных уреаплазмозом до лечения (50 пациенток)

Показатели	Степень нарушения микробиотопа влагалища
Промежуточный тип, n=5*	Дисбиоз, n=22**	Бактериальный вагинит, n=64***
Номера столбцов	1	2	3	4
Степень чистоты мазка:	II, n=5	III, n=22	III, n=5	IV, n=18
Морфология мазка:
обсеменённость эпителиоцитов	38,2+8,2	78,2+14,3	90,4+20,3	154,7+27,2
лейкоциты	16,2+2,4	34,6+4,2	39,8+7,2	52,6+7,4
ключевые клетки	0	3,2+0,3	5,2+1,3	5,8+0,6
Микрофлора, lgКОЕ/г:
лактобациллы	4,3+0,2/5,8+0,4	3,45+0,65/4,95+0,3	1,7+0,8 / 3,5+0,7
бифидобактерии	3,2+1,2/4,2+0,8	0/0	0/0
условно-патогенная:
факультативные анаэробы:	3,8+0,2/2,3+0,4	5,2+1,2/3,8+0,2	7,8+2,4 / 6,4+1,8
облигатные анаэробы:	3,2+0,6/4,5+0,4	4,2+0,6/5,8+1,6	6,2+1,4 / 8,2+1,2
Иммуноглобулины, мкг/мл:
IgM	6,8±0,5	19,6+1,4	32,3+9,6
IgG	38,1+2,7	65,5+12,3	234,38+32,7
IgА	6,7+0,3	12,3+2,7	24,6+4,2
sIgА	12,6+0,8	26,8+2,7	38,4+6,8
Sc	16,2+1,4	36,3+4,2	76,3+12,7

Примечания: в числителе показатели просветной микрофлоры, а в знаменателе – пристеночной; n – количество пациенток в группе, достоверность различий показателей в столбцах 1 и 2, 2 и 3 p<0,05, 1 и 3 - p<0,01.

Наиболее часто при уреаплазменной микст-инфекции выявлялись пептострептококки, стрептококки, энтерококки, стафилококки и грибы рода Candida – от 42% до 56% (табл. 2). Частота выявления b-гемолитических стрептококков составляла 4%, пептококков, пропионибактерий, коринебакте-рий, кишечной палочки, бактериодов и фузобактерий находилась в пределах 8-20%, гарднереллы выявлялись у 22% обследованных. Содержание лактобацилл у больных достоверно ниже по сравнению с промежуточным типом (II тип микробиоценоза) при дисбиозе (III тип) при р<0,05, вагините (IV тип) при р<0,01, а по сравнению с типом III при вагините при р<0,05. Содержание условно-патогенной флоры достоверно выше по сравнению с типом II при типе III (р<0,05) и типе IV (р<0,01), а по сравнению с типом III при типе IV (р<0,05). Содержание факультативных анаэробов достоверно выше в просветной области (p<0,05), а облигатных анаэробов достоверно выше в пристеночной области (p<0,05).

Таким образом, при дисбиотических нарушениях биотопа влагалища у больных с уреаплазмозом наблюдалось доминирование факультативно-анаэробной флоры в просветной области или облигатно-анаэробной флоры в пристеночной области влагалища при общем снижении уровня протективной флоры – лактобацилл по сравнению с нормоценозом.

При одинаковой степени воспалительного процесса, у больных выявлялись более выраженные изменения микроэкологии влагалищного биотопа по сравнению с контрольной группой. При бактериальном вагините у больных выявлялись 3-х и более компонентные ассоциации УПМ. Ассоциации, вызывающие выраженные дисбиотические нарущения влагалищного биотопа, были представлены энтеробактериями и энтерококками, стрептококками, стафилококками и грибами рода Candida, облигатно-анаэробными бактериями. Наблюдалось преобладание факультативных анаэробов в просветной области и облиганых анаэробов в пристеночной области влагалища.

Корреляционный анализ микробиологических и иммунологических показателей с учетом типа влагалищного микробиоценоза (табл. 3) у здоровых

Таблица 3. Корреляция микробиологических и иммунологических характеристик биотопа влагалища здоровых женщин и больных с уреаплазменной инфекцией при различных типах микробиоценоза

Показатели	Нормоценоз	Промежуточный тип	Дисбиоз	Вагинит
Содержание УПМ, lg КОЕ/г:
	2,15±0,25/2,35±0,3	3,5±0,3/3,25±0,4	4,7±0,9/5,1±0,4	6,4±1,8/8,2±1,4
Содержание иммуноглобулинов, мкг/мл:
IgA	0	6,7±0,3	12,3±2,7	24,6±4,2
sIgA	6,3±0,4	12,6±0,8	26,8±2,7	38,4±6,8
IgM	0	6,8±0,5	19,6±1,4	32,3±9,6
IgG	7,6±0,8	38,1±2,7	65,5±12,3	234,38±32,7
Sc	8,2±0,6	16,2±1,4	36,3±4,2	76,3±12,7
Корреляция (r) содержания УПМ и изотипа иммуноглобулина:
r IgA	-	0,17/0,14	0,58/0,62	0,72/0,74
r sIgA	0,14/0,12	0,24/0,22	0,69/0,63	0,86/0,92
r IgM	-	0,23/0,21	0,74/0,76	0,78/0,82
r IgG	0,17/0,19	0,19/0,20	0,63/0,64	0,86/0,94
r sc	0,23/0,21	0,21/0,23	0,65/0,67	0,75/0,76

Примечания: – в числителе показатели просветной микрофлоры, а в знаменателе – пристеночной; -r - при p<0,05; УПМ – условно-патогенные микроорганизмы