На правах рукописи
НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОДИАГНОСТИКИ И МЕХАНИЗМЫ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА
14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология,
03.02.03 – микробиология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Москва – 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени Минздравсоцразвития России
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, | Караулов |
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор, | Винницкий |
Доктор медицинских наук, профессор | Дидковский |
Доктор медицинских наук, профессор | Михайлова |
Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский
университет Росздрава
Защита состоится « » ___________2011 года. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 при ГОУ ВПО Первый МГМУ имени Минздравсоцразвития России Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГОУ ВПО Первый МГМУ
имени Минздравсоцразвития России Москва,
Нахимовский проспект.
Автореферат разослан « » _____________ 2011 г.
Ученый секретарь |
Акутальность проблемы
Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире ( и др., 2006; Donatella et al., 2008). Инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются традиционно значимыми на протяжении последних лет. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 330 млн. урогенитальных инфекций, среди которых число заражений хламидиозом достигает 100 млн. человек. Ежегодно в мире регистрируется около 90 млн. новых случаев хламидийной инфекции. Ureaplasma urealyticum является одним из ведущих этиологических агентов воспалительных заболеваний женской половой сферы (цервицитов, эндометритов, сальпингоофоритов, хореоамнео-нитов) и неонатальных инфекций. Частота выявления U. urealiticum у женщин репродуктивного возраста достигает 46%, а при наличии хронического воспалительного процесса в различных отделах половой системы достигает 70%. Наблюдается широкое распространение уреаплазм среди клинически здоровых женщин. Патогенный потенциал хламидий и уреаплазм определяется их концентрацией в организме, наличием других, в том числе патогенных бактерий и вирусов (гонококки, трихомонады, хламидии, микоплазмы, вирус простого герпеса I и II типа, ЦМВ др.), изменением физиологического и иммунного статуса, соматическими заболеваниями и другими факторами.
Клинические варианты течения хламидийной и уреаплазменной инфекций в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации. Слизистые содержат элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституцио-нальной рецепторной системы организма, и в комплексе с другими гуморальными и клеточными факторами мукозального иммунитета определяют эффективность колонизационной резистентности слизистых макроорганизма (один из важных интегральных компонентов местного иммунитета). Способность микрофлоры данного биотопа и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему от патогенной микрофлоры, в литературе обозначают как «колонизационную резистентность».
При инфекциях, недостаточно или чрезмерно агрессивный, воспалительный ответ хозяина обусловливает тяжесть патологического процесса, степень выраженности клинических проявлений и осложнений инфекционного заболевания. Выраженное воспаление при инфицирование урогенитального тракта Ch. trachomatis приводит к воспалению фаллопиевых труб, рубцеванию и бесплодию. Сниженный или недостаточный иммунный ответ способствует развитию инфекционного процесса путем распространения и сохранения возбудителя в различных тканях и органах. Пути распространения хламидийной инфекции могут реализоваться только при условии несостоятельности защитно-биологических барьеров организма, регулируемых врожденной иммунной системой. Рецепторы врождённого иммунитета рассматриваются как потенции-альные регуляторы ответа организма на возбудителей инфекционных заболеваний и на хламидии, в частности, TLR-4 и TLR-2- одни из наиболее важных рецепторов, не только весьма интенсивно вовлеченные в антимикробную защиту хозяина, но и гены которых способны активироваться при инфицировании Ch. trachomatis (Darville T. et al., 2003; Pioli P. A. et al., 2004).
Детальное изучение жизненного цикла хламидий и уреаплазм, фенотипических признаков, особенностей структуры генома возбудителей, влияния последних как монопатогенов, так и в ассоциации с условно-патогенными микроорганизмами, на формирование вторичного иммунодефицита на организменном и мукозальном уровнях необходимо для установления новых патофизиологических и иммунологических патогенетических механизмов развития этих инфекций. Тем самым, сократится колоссальный разрыв между фундаментальными исследованиями биологии и морфологии хламидий и уреаплазм и клиническими исследованиями заболеваний, которые они вызывают, в ряде случаев позволит объяснить отсутствие симптоматики, возможность атипичных проявлений, бессимптомного течения инфекции. Кроме того, это открывает новые возможности совершенствования и повышения информативности методов диагностики, лечения и профилактики, а также создания фармпрепаратов, воздействующих губительно на все формы цикла развития хламидий и уреаплазм, и новых иммуномодулирующих препаратов, вакцин с целью наиболее эффективного лечения и профилактики этих заболеваний.
Цель исследования
Целью исследования явилось установление роли организменного и местного иммунитета в патогенетических механизмах и клинических проявлениях при урогенитальных хламидийной и уреаплазменной инфекциях у женщин репродуктивного возраста.
Задачи исследования
1.Провести сравнительную оценку вторичного иммунодефицита, осложняющего хламидийную и уреаплазменную инфекции.
2.Выявить патогенетический, диагностический и прогностический потенциал микробиоценозов урогенитального тракта женщин при хламидийной и уреаплазменной инфекциях.
3.Оценить роль рецепторов врождённого иммунитета в патогенезе, а также диагностическое и прогностическое значение регистрации показателей их уровней при урогенитальной хламидийной инфекции женщин.
4.Изучить колонизационную резистентность слизистой цервикального канала при урогенитальной хламидийной инфекции.
5.Установить клинико-диагностические и прогностические возможности выявления фенотипических и генотипических (серологических) особенностей возбудителя при урогенитальной хламидийной инфекции.
Научная новизна работы
Впервые показано, что выраженный длительный вторичный иммунодефицит является неотъемлемой частью патологических проявлений при урогенитальных хламидийной и уреаплазменной инфекциях, на организменном уровне проявляющийся повышенной восприимчивостью к бактериальным и вирусным агентам, высокой частотой выявления воспалительных процессов гениталий; на местном уровне (слизистые) – относительно слабо выраженной воспалительной реакцией, дисбаллансом в цитокиновом и иммуноглобулиновом звеньях, угнетением нормофлоры (лактобациллы и бифидобактерии), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, что в сочетании способствует нарушению колонизационной резистентности слизистых как основного компонента мукозального иммунитета.
Впервые комплексно оценена просветная и пристеночная микрофлора влагалища и показатели иммуноглобулинов секрета влагалища клинически здоровых женщин и пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией. Выявлено резкое снижение колонизационной резистентности, характеризующееся появлением и/или значительным увеличением в просветной и пристеночной областях ассоциаций условно-патогенных факультативно (стрептококки, стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, кандида)- и облигатно-анаэробных микрооганизмов (пептострептококки, пептококки, гарднереллы, бактероиды, фузобактерии) и изменением показателей иммуноглобулинов секрета влагалища у пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией, по сравнению с клинически здоровыми.
При хламидийной инфекции микроорганизмы, попадая на слизистые УГТ, взаимодействуют с рецепторами врождённого иммунитета и запускают воспалительную реакцию. Различные уровни активации рецепторов TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Показатели уровней обсеменённости УПМ Цк, Ур и Вл прямо коррелировали с показателями уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. Низкие уровни экспрессии генов TLR-4 при осложненном инфекционном процессе свидетельствуют о переключении TLR-4 типа иммунного ответа на TLR-2. Повышение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4, как в Цк, так и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений, зависящей как от хламидий, так и от ассоциатов (возбудителей ИППП и УПМ). Во Вл имеет место экспрессия генов TLR-2 и TLR-4 в ответ на УПМ, а в Цк и Ур – на УПМ и ИППП. Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выраженно в ответ на УПМ и менее выражено при контакте с нормофлорой.
Впервые установлена определяющая роль TLR-2 и TLR-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обусловливает хроническое течение УГХ. При воспалении шейки матки/уретры более чем у половины женщин с хроническим рецедивирующим течением УГХ наблюдается снижение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (в полтора-два раза ниже значений у клинически здоровых пациентов), сопровождаемое уменьшением лейкоцитарной реакции. Как про-, так и антиапоптозная активности хламидий определяют характер развития инфекции: продуктивная инфекция либо персистенция.
Выявленные однотипные изменения показателей уровня экспрессии TLR-2 и TLR-4 в Цк и Ур пациенток с хронической формой хламидийной инфекции указывают на развитие "феномена рецепторной депрессии", сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакции. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. При острой хламидийной инфекции выявление низких уровней TLR-2 и TLR-4 указывает на возможность начала хронизации инфекционного процесса.
Впервые выявлена при УГХ в УГТ взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета TLR-2 и TLR-4 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа (в том числе, с нормофлорой) определяет колонизационную резистентность слизистых и характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер.
При хламидийной инфекции впервые выявлена зависимость выраженности патологического процесса и клинических проявлений от наличия и сочетания отдельных патогенетических факторов (плазмиды, функциональное состояние гена IncA, принадлежность штамма хламидий к конкретному генотипу, одновременное инфицирование штаммами хламидий с разными генотипами и возможность обменивания между ними генетической информацией с появлением другой разновидности хламидийного штамма).
Теоретическая значимость работы
Впервые показано, что взаимодействие микробиоценозов слизистых урогенитального тракта и макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма. Тем самым, достоверно подтверждена роль микроорганизмов в обучении защитных систем макроорганизма в динамике онтогенеза. Формирование вторичного иммунодефицита является неотъемлемым патогенетическим фактором инфекционного процесса, обусловливающего, в конечном счёте, прогноз и исход заболевания.
Впервые выявлено, что взаимодействие микроорганизмов биотопов слизистых, а также возбудителей инфекционных заболеваний с рецепторами врождённого иммунитета является необходимым фактором запуска инфекционного процесса.
Впервые представлена колонизационная резистентность как неотъемлемая часть мукозального иммунитета.
Впервые показано влияние фенотипических и генотипических свойств возбудителя на выраженность патогенетического процесса, клинических проявлений при хламидийной урогенитальной инфекции.
Практическая значимость работы
Получен патент РФ «Способ оценки микробиоценоза влагалища» № 000. Зарегистрирован 10.04.2005. Предложена новая медицинская технология «Оценка микробиоценоза влагалища при инфекционных и других заболеваниях женской половой сферы», утверждена Минздравсоцразвитием: Разрешение на применение новой медицинской технологии. Серия АА. № 000. ФС № 000/187 от 01.01.2001. Разработаны и предложены лабораторные критерии диагностики урогенитального хламидиоза с установлением острой и хронической рецидивирующей формы заболевания, защищённые Патентом РФ «Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза» № 000. Зарегистрирован 27.06.2008 г. На разработаный способ мультиплексной ПЦР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis, получен Патент РФ «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2 зарегистрирован 10.04.2010, (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений России») и Патент РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2 зарегистрирован 10.04.2010 (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений Росси»).
Положения, выносимые на защиту
Хламидийная и уреаплазменная инфекции сопровождаются развитием длительного вторичного иммунодефицита. Последний наиболее выражен при урогенитальном хламидиозе и проявляется на местном уровне относительно слабо выраженной воспалительной реакцией при остром и обострении хронического хламидиоза, угнетением нормофлоры (лактобацилл и бифидобактерий), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, а в дальнейшем развитием у переболевших кольпита, эрозии шейки матки, сальпингоофорита.
Изменения уровней микробиологических и иммунологических показателей биотопа влагалища отражают патогенетические механизмы при хламидийной и уреаплазменной микст-инфекциях и могут быть диагностическими и прогностическими показателями течения инфекционного процесса.
Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются TLR-2 и TLR-4.
Впервые описан алгоритм запуска колонизационной резистетности слизистой цервикального канала: TLR слизистых реагируют на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, sIgA и секреторного компонента (sc), что в комплексе и определяет колонизационную резистентность.
Впервые доказана связь генотипических и фенотипических свойств возбудителей с патогенетическими механизмами и особенностями клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследований и разработок используются в научных исследованиях кафедры клинической аллергологии и иммунологии Первого Московского государственного медицинского университета имени .
Апробация работы
Материалы исследования и основные положения работы доложены на заседании совместной научной конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования врачей и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии медико-профилактического факультета Первого Московского государственного медицинской университета им. 25 февраля 2011 года, на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.), на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007 г.), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.), IV международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербурского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008г.), Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2-3 октября 2008г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009г.), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009г.), The 3rd Congress of European Microbiologists «Microbes and Man – interdependence and future challenges» (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009), XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011г.).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведено моделирование процессов, мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической клинико-иммунологической и клинико-бактериологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 24 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых ВАК, 4 патента РФ на изобретения.
Структура и объём диссертации
Работа изложена на 230 страницах текста, иллюстрирована 23 таблицами, 16 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 355 источников, в том числе 131 отечественных и 224 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 50 женщин в возрасте 18-36 лет, с установленной уреаплазменной моно - и микст-инфекцией. U. urealiticum выявлялась у всех больных в диагностическом титре более чем 104 КОЕ/мл. Контрольная группа (группа сравнения) включала 40 клинически здоровых женщин.
Клинико-анамнестические и лабораторные данные 228 больных с УГХ позволили отобрать 100 пациенток и 32 клинически здоровых женщин, которые были разбиты на 4 группы. Группу I составила 41 пациентка. Положительные результаты ПИФ, ПЦР и культурального посева подтверждали наличие Ch. trachomatis в УГТ. В сыворотке крови данных больных в ИФА определялись IgG-Ат в титре 1:50-100. Повторный лабораторный анализ на наличие антител (через 2-3 недели) показал появление IgМ-Ат (в титре 1:50 и выше), что свидетельствовало о первичном инфицировании больных и острой стадии инфекционного заболевания. Пациентки отрицали наличие ранее перенесенного хламидиоза. Группу II составляли 29 пациенток. В сыворотке крови определялись стойкие титры IgА-Ат (1:100-1:200) и IgG-Ат (1:100-1:200), концентрация которых не изменялась на протяжении длительного периода. Длительность заболевания составляла от 3 до 5 лет. Положительные результаты ПИФ, культурального посева и ПЦР свидетельствовали о лабораторно подтверждённом рецидиве УГХ. Схожесть клинических проявлений и наличие двух эпизодов обострения заболевания в течение предшествующих 12 месяцев свидетельствовали о хроническом течении хламидийной инфекции. Рецидивы отмечались с частотой 1 раз в полгода. Все больные неоднократно получали антибактериальную терапию, однако не наблюдалось стойкого клинического и бактериологического положительного эффекта. В группу III (группа сравнения) вошли 30 пациенток, в анамнезе которых ранее диагностировался УГХ. Отсутствие IgА-Ат и низкие, не меняющиеся во времени титры IgG-Ат (1:50) свидетельствовали о давно перенесённой хламидийной инфекции. Об этом свидетельствовали и IgG-Ат в титрах 1:100-200, уровни которых снижались в течение 12 месяцев. Маркёры хламидий в УГТ не выявлялись ни одним из использованных методов диагностики в течение одного года. В группу IV (контрольная, группа сравнения) включили 32 клинически здоровые женщины. Клинико-лабораторное обследование подтвердило отсутствие признаков хламидийной инфекций и ИППП, а также наличия гинекологической патологии. Возраст обследованных пациенток варьировал от 20 до 39 лет.
Дополнительно проведено клинико-лабораторное обследование 99 пациентов с подозрением на хламидиоз и 39 клинически здоровых пациентов.
По возрасту, общему соматическому статусу, репродуктивному состоянию, выраженности клинических проявлений, социальному положению и уровню образования пациентки всех групп были сопоставимы.
Диагноз УГХ устанавливался на основании результатов стандартных клинико-инструментальных методов обследования (, 2004; и др., 2004): исследования клинического мазка из Цк, соскобного материала световой микроскопией проб с последующей обработкой флуоресцентными моноклональными Ат к Ch. trachomatis и методом ПЦР, выделения хламидий на культуре клеток McCoy. Дополнительным критерием служил анализ уровней титров IgG-Ат, IgA-Ат в сыворотке крови методом ИФА (medac Diagnostika Gmbh, Германия). Обследование проводили на первой и третьей неделе после первичного обращения; повторные исследования проводились спустя один-два месяца после антибактериальной терапии. Критерием излеченности считали отсутствие маркеров Ch. trachomatis в УГТ.
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 50 женщин в возрасте 18-36 лет, с установленной уреаплазменной моно - и микст-инфекцией. Выявление, определение титра и антибиотикочувствительности уреаплазм проводили с использованием тест-систем «MYCOPLASMA DUO» (BIO-RAD, Франция), позволяющих получить пороговые концентрации возбудителя в клинической пробе. Диагноз подтверждён обнаружением у всех больных возбудителя в исследуемом материале в титре более чем в 104 КОЕ/мл, что свидетельствало о наличии выраженного инфекционного процесса.
Инфицированность возбудителями ИППП: ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, микоплазмами, уреаплазмами, токсоплазмами, кандидами – устанавливалась общепринятыми методами ПЦР, а микоплазмами, уреаплазмами – дополнительно ИФА методом. Инфицирование ВПГ, ВПЧ и ЦМВ подтверждали дважды.
Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ
Материалам для микроскопического исследования служили уретральные, вагинальные и цервикальные мазки ( и др., 2004) с последующей окраской по Романовскому-Гимзе для характеристики лейкоцитарной реакции и клеточного состава, а другой - по Граму - для характеристики микрофлоры. Материал забирали стерильными ватными тампонами из Цк, Вл и Ур и наносили на обезжиренные предметные стекла.
Микробиологические исследования
Материал с поверхности заднего свода влагалища собирали до мануального исследования после введения зеркал. Для оценки состояния просветной флоры забор материала производился стерильным ватным тампоном, а для оценки состояния пристеночной флоры - с помощью урогенитальных зондов, позволя-ющих получить при соскобе со слизистой слой поверхностных эпителиальных клеток. Полученный материал помещали в коллекторы с транспортной средой «Amies», содержащей фармакологический активированный уголь, для доставки в лабораторию. С Цк и Ур забирали мазки-соскобы с помощью урогенитальных зондов. Согласно экспериментальным данным количество исследуемого матери-ала при заборе тампоном составляло 0,5 г, урогенитальным зондом - 0,2 г. Бактериологическое исследование отделяемого цервикального канала, уретры и влагалища проводили общепринятым методами в соответствии с Приказом МЗ СССР № 000.
Оценка выраженности нарушений микробиоценоза влагалища.
Проводилась в соответствии с предложенной нами и утверждённой Минздравсоцразвитием новой медицинской технологией:
нормоценоз влагалища определяется при наличии на поверхности эпителиоцитов менее 25 бактериальных клеток, представленных грамположи-тельными палочками, при количестве лейкоцитов менее 10 в поле зрения, при отсутствии ключевых клеток (I степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 6-8 lg КОЕ/г лактобацилл, при содержании в соскобном материале 7-10 lg КОЕ/г лактобацилл, при отсутствии в отделяемом и в соскобном материале условно-патогенной факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA 0 мкг/мл, sIgA £ 10 мкг/мл, IgM 0 мкг/мл, свободного секреторного компонента £ 10 мкг/мл;
промежуточный тип микробиоценоза влагалища при наличии на поверхности эпителиоцитов 25-50 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, единичными грамположительными кокками и грамотрицательными палочками, при количестве лейкоцитов 10-20 в поле зрения, при отсутствии ключевых клеток (II степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 4-5 lg КОЕ/г лактобацилл, 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 5-6 lg КОЕ/г лактобацилл, 1-2 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA £ 10 мкг/мл, sIgA 11-15 мкг/мл, IgM £ 10 мкг/мл, свободного секреторного компонента 10-25 мкг/мл;
дисбиоз влагалища при наличии на поверхности эпителиоцитов 50-100 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, грамположительными кокками и грамотрицательными палочками, при количестве лейкоцитов 20-40 в поле зрения, при наличии ключевых клеток менее 5 в поле зрения (III степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 1-3 lg КОЕ/г лактобацилл, 5-7 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной микрофлоры и 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 3-4 lg КОЕ/г лактобацилл, 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной микрофлоры и 5-7 lg КОЕ/г условно-патогенной облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA 11-15 мкг/мл, sIgA 16-30 мкг/мл, IgM 11-20 мкг/мл, свободного секреторного компонента 26-50 мкг/мл;
бактериальный вагинит при наличии на поверхности эпителиоцитов не менее 100 бактериальных клеток, представленных единичными грамположительными палочками и обильной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой флорой, при количестве лейкоцитов не менее 40 в поле зрения, при количестве ключевых клеток не менее 5 в поле зрения (IV степень чистоты мазка), при отсутствии в отделяемом лактобацилл, при содержании в отделяемом 5-6 lg КОЕ/г монокультуры условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 1-3 lg КОЕ/г лактобацилл, 6-8 lg КОЕ/г монокультуры условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA > 15 мкг/мл, sIgA > 30 мкг/мл, IgM > 20 мкг/мл, свободного секреторного компонента > 50 мкг/мл.
Штаммы микроорганизмов
В качестве положительных контрольных образцов возбудителей хламидиоза выступали референс штаммы Chlamydophila pneumoniae – «B» и Chlamydia trachomatis – «Бурхан», полученные из Государственной Коллекции Вирусов (ГКВ) ГУ НИИ Вирусологии им. РАМН. Штаммы Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae, полученные от пациентов сохранялись в жидком азоте для дальнейшего изучения свойств.
Молекулярно-генетические методы исследования
Определения экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. Исследования проводили по предложенной оригинальной методике. Материалом для исследования служили мазки-соскобы со слизистой соответствующих участков УГТ, содержащие элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма (Sandor F., Buc M., 2005). В день обследования у женщины забирали мазки-соскобы со слизистых Вл, Цк и Ур с помощью стерильного урогенитального зонда, позволяющие получить со слизистой слой поверхностных эпителиальных клеток. Согласно экспериментальным данным количество исследуемого материала при заборе урогенитальным зондом составляло – 0,2 г. Содержимое зондов тщательно суспендировали в забуференном физиологическом растворе в пробирках типа "Эппендорф" с последующим определением количества всех клеточных элементов с помощью слайд-планшета (Плива-Лахема, Чехия). Конечная концентрация клеток в образце составляла не более 1×105 клеток в мл. Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург) в соотношении объемов суспензии клеток к раствору, равному 1:5. Уровень экспрессии генов TLR определялся методом ПЦР в режиме реального времени (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров к TLR-2 (TLR2-F1 – CCTTCACTCAGGAGCAGCAAGC; TLR2 – R1-TGGAAACGGTGGCACAGGAC) и TLR-4 (TLR4-F6 – GAAGGGGTGCCTCCATTTCAGC; TLR4-R6 – TGCCTGAGCAGGGTCTTCTCCA). Уровни экспрессии mRNA TLR контролировали (стандартизировали) по гену GAPTAH (GAPDH-F1 – TGCMTCCTGCACCACCAACT; GAPDH-F2 – YGCCTGCTTCACCACCTTC) за счет сходной экспрессии этого гена среди тканей человеческого репродуктивного тракта. Из исследуемого материала выделяли тотальную RNA согласно протоколу к наборам для выделения тотальной RNA на магнитных частицах SiO2 – бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург). Синтез первой цепи кDNA проводили согласно указаниям инструкции «Набора для синтеза первой цепи кDNA (базовый)» (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург). Амплификацию с последующим определением уровня экспрессии TLR проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора АМК-32 ("Синтол", Россия) и специфических праймеров к TLR-2 и TLR-4 ("Синтол", Россия). Праймеры для последовательностей к TLR-2, TLR-4 и были подобраны с помощью программы Vector NTI. Последовательности mRNA TLR-2, TLR-4 и GAPDH взяты в GenBank и синтезированы фирмой Синтол (Москва). Количество исследуемых кDNA в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР в РВ на образцах серийных разведений очищенного ПЦР-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кDNA в пробе проводилась с помощью отношений TLR2/GAPDH и TLR4/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ).
ПЦР диагностика хламидийной инфекции
В работе использовали основной молекулярно-генетический метод – ПЦР. Экстракцию DNA проводили с помощью набора для выделения DNA из мазков-соскобов «DNA-сорб-АМ» (НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, регистрационное удостоверение №ФСР 2007/00183). Для ПЦР амплификации DNA Ch. trachomatis использовали набор реагентов «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-EPh» (НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, регистраци-онное удостоверение № ФСР 2007/00683). Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов DNA в 2% агарозном геле. Все этапы выполнялись согласно инструкции производителя.
Для видовой мультиплексной детекции и идентификации Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae впервые применены подобранные оригинальные универсальные праймеры на фрагмент гена 16S rRNA: для Chlamydia trachomatis – Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3', для Chlamydophila pneumoniae Cpn: 5'-CGGAATAACGACTTGAGTTG-3', общий реверс праймер для обоих видов R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3'. Размер продукта амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для Chl. pneumoniae – 440 пар нуклеотидов, для Ch. trachomatis – 334 пары нуклеотидов. Для детекции штаммов Ch. trachomatis, несущих плазмиду и свободных от нее, была впервые предложена следующая оригинальная комбинация праймеров: Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' и R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3' для амплификации фрагмента16S rRNA гена (334 пары нуклеотидов); PLf: 5'-TTCGAGGCGAGTAACGAAGA-3' и PLr: 5'-AAGCAACGCGCGCGATAGGT-3' для амплификации участка криптической плазмиды Ch. trachomatis (241 пара нуклеотидов). Молекулярно-генетическое типирование штаммов
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 |
