превалировали нескольких типов ВПЧ (16, 18 и 35) с высокой онкогенной способностью. По частоте выявляемости УПМ в Цк (табл. 4) достоверные различия выявлены между I и III группами (c2=5,470, р<0,01), I и IV группами (c2=20,800, р<0,001), II и IV группами (c2=7,310, р<0,001), III и IV (c2=4,460, р<0,01), а между I и II, II и III группами различия не достоверны.

В Цк (табл. 7) выявлены достоверные различия уровней экспрессии генов TLR-2 между I и II, III и IV группами (p≤0,05), II и III, IV группами (p≤0,05), а уровней экспрессии генов TLR-4 – между I и II, III и IV группами (p≤0,05), II и III, IV группами (p≤0,05). У пациенток группы II регистрировалось достоверное снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в 2 и 2,5 раза, соответственно, относительно показателей группы I, а также они достоверно ниже таковых в группе IV. По выраженности лейкоцитарной реакции достоверные различия выявлены между I и IV группами (p≤0,001), II, III группами (p≤0,01), II и IV (p≤0,01).

Нами определена роль цитокинов цервикального канала вколонизационной резистетности слизистых.

Известно, что характер воспаления и исход взаимодействия между патогеном и механизмами противомикробной защиты хозяина в значительной мере зависят от спектра и уровня продуцируемых цитокинов. Представляется оправданным исследование полного местного цитокинового статуса с последующим выяснением роли его отдельных компонентов в течении УГХ. Уровни IL-8 в ЦС (табл. 8) у больных группы I (3780,16±421,89 пкг/мг белка) достоверно (р<0,01) выше показателей групп III (511,72±195,44 пкг/мг белка), IV (134,04±31,76 пкг/мг белка); с группой II (2781,62±676,33 пкг/мг белка) различия не достоверны (табл. 3). В группе II выявлено достоверное повышение уровней IL-8 в 3,8 раза по сравнению с таковыми пациентов группы IV. В группах III и IV показатели уровней IL-8 достоверно не различались. У больных группы I (952,1±149,13 пкг/мг белка) выявлены достоверно высокие концентрации IL-6 по сравнению с группами II (154,82±73,20 пкг/мг белка), III (43,28±12,40 пкг/мг белка) и IV (5,31±2,79 пкг/мг белка). У больных группы II показатель уровня IL-6 в ЦС достоверно выше такового в группе IV и не отличался от такового группы III. В группе III уровень IL-6 был в 8 раз выше, чем в группе IV. У больных группы I наблюдался достоверно повышенный уровень IL-1β (1515,9±364,8 пкг/мг белка) по сравнению с пациентками групп II (117,64±69,45 пкг/мг белка), III (24,67±3,81 пкг/мг белка) и IV (2,18±1,69 пкг/мг белка). В группе II в ЦС наблюдалась относительно невысокая концентрация IL-1β (достоверно отличалась от показателей пациенток групп III и IV, р<0,05). У пациенток группы I (141,29±10,30 пкг/мг белка) установлено достоверно более высокое содержание TNF-α в ЦС, чем в группах II (25,63±7,75 пкг/мг белка), III (7,24±2,13 пкг/мг белка) и IV (2,63±1,30 пкг/мг белка). В группе II уровень TNF-α достоверно выше чем в группе III, в 9 раз превышал значения показателей в группе IV. У пациентов групп III и IV отмечались низкие значения TNF-α в ЦС, которые достоверно не различались между собой. Уровни IFN-γ в ЦС (415,66±159,90 пкг/мг белка) у больных группы I статистически значимо (р<0,05) отличались от таковых у пациенток групп II (26,69±9,50 пкг/мг белка), III (4,47±1,61 пкг/мг белка) и IV (3,13±1,35 пкг/мг белка). В группе II уровни IFN-γ были достоверно выше таковых в группах III и IV. Содержание IFN-γ в группах III и IV было на низком уровне и статистически не различалось. Показатели концентраций IL-4 ЦС в группе I (24,83±18,44 пкг/мг белка) достоверно выше показателей у пациенток групп III (6,2±1,56 IV пкг/мг белка) и IV (3,98±1,38 пкг/мг белка); с группой II различия не достоверны. Не установлено достоверной динамики показателей уровней экспрессии IL-4 в группах II и III по сравнению с группой IV.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

В I группе наблюдалась средняя корреляционная связь (r=0,62) между УПМ и TLR-2, между УПМ и TLR-4 (r=0,46), между TLR-2 и TLR-4 (r=0,54). Установлена сильная корреляционная связь между уровнем лейкоцитоза и уровнем TLR-2 (r=0,68) и средняя с уровнем TLR-4 (r=0,41). Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 сильно коррелировали с содержанием цитокинов IL-8 (r=0,88 и r=0,82, соответственно), IL-6 (r=0,75 и r=0,72, соответственно), IL-1β (r=0,78 и r=0,79, соответственно); регистрировалась средняя корреляционнаясвязь с уровнями цитокина TNF-α (r=0,69 и r=0,62, соответственно), IFN-γ (r=0,52 и r=0,48, соответственно); достоверной взаимосвязи между содержанием IL-4 и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Наиболее значительное повышение уровней IL-8, TNF-α и IL-1β в ЦС наблюдалась у впервые инфицированных пациенток, то есть с ранним сроком заболевания. Выявлена слабая корреляционная зависимость между уровнем белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 r=0,3 (р<0,05), между уровнем белка и секреторным иммуноглобулином – sIgA, секреторным компонентом – sc (r=0,35 и r=0,39, соответственно); средняя между уровнем белка и IgG (r=0,42), между уровнем IgG и уровнями экспрессии генов TLR-4 (r=0,49),

Таблица 8. Уровень экспрессии генов TLR и изучаемых цитокинов в
слизистой цервикального канала женщин с урогенитальным хламидиозом

Группы

пациентов, n

Уровень

экспрессии, ОЕ

Уровень цитокинов, пкг/мг белка, M±m

TLR-2

TLR-4

IL-8

TNF-α

IL -6

IL -12

IL -9

IL -4

IL -1β

IFN-γ

IL -10

GM-CSF

I, 41

57,0±

9,95

34,8±

1,72

3780,16±

421,89

141,29±

10,30

952,10±

149,13

2,96±

1,22

28,58±

13,36

24,83±

18,44

1515,9±

364,8

415,66±

159,90

7,55±

2,99

13,76±

5,66

II, 29

5,71±

1,07

8,01±

1,08

2781,62±

676,33

25,63±

7,75

154,82±

73,20

1,78±

0,39

32,74±

3,76

17,6±

10,83

117,64±

69,45

26,69±

9,50

9,56±

8,33

16,39±

8,94

III, 30

18,67±

2,39

13,5±

0,93

511,72±

195,44

7,24±

2,13

43,28±

12,40

2,83±

0,95

31,53±

3,21

6,20±

1,56

24,67±

3,81

4,47±

1,61

3,86±

1,15

5,30±

4,71

IV, 32

17,02±

2,10

13,8±

1,9

134,04±

31,76

2,63±

1,30

5,31±

2,79

2,61±

0,76

22,69±

10,47

3,98±

1,38

2,18±

1,69

3,13±

1,35

2,49±

1,22

4,62±

2,74

Примечания: I-IV - группы пациентов; n - количество пациентов в группе.

не выявлено корреляционной связи между IgG и TLR-2 (r<0,10), а также между уровнем белка и цитокинами, между уровнями иммуноглобулинов и цитокинами. После лечения установлена сильная корреляционная связь между количеством IL-8 в ЦС и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в группе I (rs > 0,8) средняя – в группах II и III (rs = 0,7 и rs = 0,6, соответственно) и слабая корреляционная связь в группе IV (rs = 0,35).

При остром хламидиозе в ответ на высокую инфекционную нагрузку (хламидии в виде моно - или микстинфекции с возбудителями ИППП и/или с УПМ) повышаются уровни экспрессии генов TLR-2, TLR-4, запускающие в Цк выраженную продукцию IL-8, TNF-α и IL-1β, приводящих, в свою очередь, к увеличению содержания лейкоцитов, белка и Ig у пациенток, что можно расценивать как выраженную местную (преимущественно по клеточному типу) иммунологическую реакцию макроорганизма, отражающую остроту инфекционного процесса и способствующую развитию воспалительной реакции и локализации распространения инфекции за пределы шейки матки, а также стимуляции продукции дополнительных цитокинов соседними неинфицированными клетками. В ЦС нарастание уровней IgG связано с местным синтезом и экссудацией, а выявление sIgA и sc обусловлено их синтезом in situ.

В группе II (табл. 4, 7, 8) в Цк между УПМ и TLR-2 (r=0,35), УПМ и TLR-4 (r=0,26), TLR-2 и TLR-4 (r=0,34) установлена слабая корреляционная связь, уровень лейкоцитоза сильно коррелировал с уровнем TLR-2 (r=0,74) и уровнем TLR-4 (r=0,68). Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 сильно коррелировали с IL-8 (r=0,71 и r=0,69, соответственно); средняя корреляционная связь выявлена между уровнями IL-6 и экспрессией генов TLR-2 (r=0,62) и TLR-4 (r=0,61), между IL-1β и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,63 и r=0,58, соответственно); уровень TNF-α обратно коррелировал с уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=-0,63 и r=-0,58, соответственно); определялась средняя корреляционная связь уровней IFN-γ с показателями экспрессии генов TLR-2 (r=48) и слабая с TLR-4 (r=0,32); достоверной взаимосвязи между содержанием IL-4 и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Только в группе II выявлена достоверная средняя корреляционная связь между IL-8 и УПМ (r>0,53), между IL-6 и УПМ (r=0,49). Установлены средняя корреляционная зависимость между содержанием белка и IgG (r=0,51) и её отсутствие с sIgA и sc. Показатели sIgA и sc коррелировали с уровнями экспрессии генов TLR-2 (r=0,77) и TLR-4 (r=0,29), а показатели содержания IgG – с TLR-2 и TLR-4 (r=0,48 и r=0,32, соответственно), УПМ – с IgG - r=0,73. Таким образом, при хроническом хламидиозе в ответ на высокую инфекционную нагрузку (хламидии в виде моно - или микстинфекции с другими возбудителями ИППП и/или УПМ) уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 не повышаются (ниже уровней у переболевших и клинически здоровых пациентов), что свидетельствует о дисфункции врождённого иммунитета. Сочетание сниженной экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с подавлением активности локального синтеза IL-8, IL-6, TNF-α, относительно слабо выраженной лейкоцитарной реакцией, пониженными уровнями sIgA и sc, повышенным содержанием общего белка и IgG, обусловливает хронический, вялотекущий воспалительный процесс, способствует прогрессирующему характеру течения инфекционного процесса и свидетельствуют о дисфункции механизмов мукозального иммунитета Цк, дисбалансе в процессах деструкции и репарации, сопутствующих воспалению. В ЦС нарастание уровней IgG связано, в основном, с местным синтезом и в меньшей степени с экссудацией через слизистую сыворотки крови, а выявление sIgA и sc обусловлено их пониженным местным синтезом.

В III группе (табл. 4, 7, 8) установлены сильная корреляционная связь между УПМ и TLR-2 (r=0,86), средняя (r=0,42) между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4 (r=-0,34) обратная слабая корреляционная связь. Выявлена средняя корреляционная связь между уровнем лейкоцитоза и уровнем экспрессии генов TLR-2 (r=0,58) и сильная с уровнем TLR-4 (r=0,74). Установлена средняя корреляционная связь между IL-8 и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r>0,61 и r=0,52, соответственно); слабая корреляционная связь - между TLR-2, TLR-4 и уровнем IL-6 (r=0,32 и r=0,29, соответственно), между TLR-2, TLR-4 и уровнем TNF-α (r=0,44 и r=0,38, соответственно), между TLR-2, TLR-4 и уровнем IFN-γ (r=0,32 и r=0,28, соответственно). Достоверной взаимосвязи между содержанием IL-1β и IL-4 и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Средняя корреляционная связь установлена между содержанием белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,40), sIgA (r=0,49). Следовательно, у больных после излечения от хламидийной инфекции в Цк инфекционная нагрузка резко снизилась и, соответственно, уменьшилась экспрессия генов TLR-2 и TLR-4, но продолжают регистрироваться остаточные проявления воспалительной реакции (несколько повышенные уровни лейкоцитов, IgG и sIgA - синтезируются местно).

В IV группе (табл. 4, 7, 8) между УПМ и TLR-2 (r=0,36), УПМ и TLR-4 (r=0,28) выявлена слабая корреляционная связь, между TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено. Установлена сильная корреляционная связь между уровнем лейкоцитоза и уровнем TLR-2 (r=0,78) и средняя - с уровнем TLR-4 (r=0,45). Имела место слабая корреляционная связь между IL-8 и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r>0,48 и r=0,35, соответственно), между IL-6 и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,26 и r=0,24, соответственно), между TNF-α и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,32 и r=0,28, соответственно), между IFN -γ и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,24 и r=0,23, соответственно). Достоверной взаимосвязи между содержанием IL-1β, IL-4 и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Средняя корреляционная связь установлена между содержанием белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (r=0,40), IgG (r=0,46). Невысокие концентрации IgG в ЦС клинически здоровых женщин (без гинекологической патологии и генитальной инфекции) объясняются небольшой антигенной стимуляцией поступающими извне микроорганизмами.

Таким образом, при УГХ в Цк взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета TLR-2 и TLR-4 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа определяет колонизационную резистентность слизистых (рис. 2) и характеризует

Рисунок 2. Взаимодействие факторов, определяющих колонизационную резистентность

течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер. Колонизационная резистетность выступает как неотъемлемая часть мукозального иммунитета. Её угнетение способствует персистированию возбудителя в организме и хронизации инфекционного процесса, что в свою очередь, создаёт предпосылки для повышения онкогенного потенциала микрофлоры биотопа. При выраженной острой или хронической воспалительной реакции в Цк уровень IgG определяется не только местным синтезом, но проникновением IgG из крови за счёт повышения проницаемости слизистой Цк.

Нами исследована связь фенотипических свойств возбудителя с клиническими проявлениями при урогенитальном хламидиозе.

Проведено обоснование создания быстрой и надежной тест-системы мультиплексной ПЦР-детекции возбудителей хламидиозов человека видов Chl. pneumoniae и Ch. trachomatis, а также мультиплексной системы, для универсальной ПЦР-детекции плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Ch. trachomatis.

Для детекции штаммов Ch. trachomatis, несущих плазмиду и свободных от нее, была впервые предложена следующая оригинальная комбинация праймеров: форвард праймер Ctr: 5'-TGGCGATATTTGGGCATCC-3' и реверс праймер R: 5'-CTTCTTTACCTGGTACGCTC-3' для амплификации фрагмента (334 пары нуклеотидов) 16S rRNA гена Ch. trachomatis; форвард праймер PLf: 5'-TCCGGAGCGAGTTACGAAGA-3' (XO6707 Gene Bank) и реверс праймер PLr: 5'-AATCAATGCCCGGGATTGGT-3' (AM886279 Gene Bank) для амплификации участка гена криптической плазмиды (241 пара нуклеотидов) Ch. trachomatis.

Материалом для исследования служили 21 штамм Ch. trachomatis и 1 штамм Chl. pneumoniae, верифицированных в мазках соскобах, а также на культуре клеток McCoy, зараженных клиническим материалом, полученным от человека с патологией органов репродуктивного тракта и органов дыхания с подозрением на хламидийную инфекцию. Идентификацию хламидий проводили окрашиванием по Романовскому-Гимзе, согласно общепринятой методике, и меченными FITC моноклональными антителами для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae в реакции прямой иммунофлуоресценции (тест-система CeLLabs, Австралия). В препаратах инфицированных клеточных культур хламидии выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет.

Из 21 штамма Ch. trachomatis, полученных из урогенитального тракта человека, при культивировании в культуре клеток (37 °C), 6 штаммов образовывали множественные внутриклеточные хламидийные включения, что свидетельствовало об отсутствии экспрессии гена incA на уровне белка, обусловливающего включения такого характера. У остальных 15 штаммов и референс штамма Ch. Trachomatis- «Бурхан» в культуре клеток выявлялись хламидийные включения в виде одного общего включения. Отсутствие экспрессии белка IncA приводит к замедлению деления РТ хламидий в клетке. Штаммы Ch. trachomatis, которые не экспрессируют данный белок, продуцируют множественные включения в клетке и вызывают субклиническую картину течения хламидийной инфекции (Rurangirwa F. R. et al., 1999). Pannekoek Y. et al. (2005) показали, что в генах IncA разных штаммов существуют различного рода мутации и это напрямую связано с фенотипом, однако зависимость экспрессии гена от мутаций выявлено не было. Следовательно, о вирулентности можно судить не только по наличию или отсутствию плазмиды но и по характеру включения: множественные включения указывают на сниженную вирулентность, возможность хронизации инфекционного процесса. Установлено довольно частое (3,7% из 27 случаев) выяление плазмидо негативных штаммов. Плазмидо негативный штамм вызывал вялое течение инфекционного процесса.

При патологии органов репродуктивного тракта человека на культуре клеток был выделен 21 штамм Ch. trachomatis, что подтверждено ПЦР с коммерческим набором и с предлагаемой системой для видовой верификации. Благодаря предлагаемой системе для верификации плазмид установлено наличие плазмид у данных штаммов (табл. 9).

Таблица 9. Детекция плазмидных и бесплазмидных штаммов хламидий у человека.

Номер

п/п

Место выделения

Плазмидные

Бесплазмидные

«АмплиСенс Ch. trachomatis-FL»

1

уретра

+

-

+

2

цервикальный канал

+

-

+

3

цервикальный канал

+

-

+

4

цервикальный канал

+

-

+

5

уретра

+

-

+

6

уретра

+

-

+

7

уретра

+

-

+

8

уретра

+

-

+

9

цервикальный канал

+

-

+

10

уретра

+

-

+

11

уретра

+

-

+

12

уретра

+

-

+

13

уретра

+

-

+

14

уретра

+

-

+

15

цервикальный канал

+

-

+

16

цервикальный канал

+

-

+

17

цервикальный канал

+

-

+

18

уретра

+

-

+

19

уретра

+

-

+

20

уретра

+

-

+

21

уретра

+

-

+

22

Ch. trachomatis-«Бурхан»

+

-

+

Примечания: + - положительный результат; - - отрицательный результат.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7