Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 3 )

Методика получения лейкоцитов с использованием гипотонического лизиса эритроцитов

Вначале берется свежая кровь и смешивается с раствором Версена. Далее при использовании RCLB смешиваем 400 мкл крови и 1100 мкл RCLB (RCLB используют для гипотонического лизиса эритроцитов). Затем инкубируем 10 минут. Центирфугируем 3000/10, сливаем надосадок, добавляем PBS и ресуспендируем. Опять центрифугируем, сливаем надосадок и ресуспендируем добавленным до 200 мкл PBSом.

Потом к этому добавляем 10 мкл крашенных сукцинимидом бактерий. Инкубируем 30 минут при 370С. Делаем мазок, сушим и смотрим на микроскопе.

Методика дифференциального центрифугирования

Вначале берется свежая кровь и смешивается с раствором Версена - изотонический раствор ЭДТА, антикоагулянт.

При использовании фиколла (d = 0,077) поступаем следующее: в пробирку вносим 1 мл фекола, затем к ниму осторожно добавляем 400 мкл крови, центрифугируем 3000/10. Берем надосадок – это мононуклеары. Добавляем к ним до 200 мкл PBSа.

Потом к ним туда же добавляем 10 мкл крашенных сукцинимидом бактерий.

Инкубируем 30 минут при 370С. Делаем мазок, сушим и смотрим на микроскопе.

Таблица 5. Схема приготовления раствора Фиколла требуемой плотности:

Плотность	d=0,077	d = 0,082
Фиколл 400	6 гр	7,3 гр
Урографин 60%	14,78 мл	17,78 мл
PBS рН = 7,4	0,35 мл	8,75 мл
Добавить воды до	200 мл	100 мл

Методика окрашивания пропидием йодидом (PI):

Предварительно готовят смесь из эукариотических клеток и бактерий с люминисцентной меткой. Затем делаем мазок и сушим стекло. Далее, для лучшего прокрашивания, промываем стекло спиртом и обрабатываем разведенным PI (маточный раствор 500 кратный) 1 мкл на 500 мкл в дистиллированной воде.

5 Определение антибиотикорезистентности в микропланшетном формате

В последнее время, довольно перспективным направлением в микробиологии, можно считать использование автоматизированных систем культивирования микроорганизмов в присутствии различных антибактериальных веществ в 96 луночных микропланшетах. Данная технология не только обеспечивает высокую производительность микробиологических исследований направленных на изучение антибиотикорезистентности микробов [46], но и облегчает автоматизированный, количественный анализ данных.

Одной из таких технологий, является выращивание микроорганизмов в лунках планшета с различными антибиотиками (концентрация которых эквивалентна терапевтической) [47].

Однако, спектрофотометрический анализ оптических плотностей в планшетах имеет некоторые отличия от фотометрии в кюветах, в частности длинна оптического пути проходящего через слой культуральной жидкости, в планшетах, может колебаться.

В связи с этим, была поставлена задача – оценить воспроизводимость таких исследований и разработать наиболее простой протокол адаптированный для производственных лабораторий.

Таблица №6. Структура планшетов
№ вертикального рядка в планшете	антибиотик
1	Зинаприм
2	Эриприм
3	Рифан
4	Апрамицин
5	Родотиум
6	Фуразолидон
7	Коливет
8	Квинабик
9	Энроколи
10	Амоксициллин
11	Энрофлон
12	Без антибиотиков

Чувствительность выделенных микроорганизмов к антибиотикам проверяли путем инкубирования в лунках полистиролового планшета в присутствии антибиотиков, в

концентрациях эквивалентных терапевтическим. После инкубации планшеты фотометрировали на ИФА-ридере «Пикон» при длине волны 540нм. Данные автоматически заносились и обрабатывались в компьютере [47].

В качестве тест объекта используют полевой изолят сальмонелл. Для работы использовали полистироловые ИФА-планшеты фирмы «Медполимер» с внесенными коммерческими антибактериальными препаратами (таблица 6)

Таблица №7 Оптическая плотность в лунках с МПБ
№ эксперимента	M+m	Квадратическое отклонение	Cv
1	0,252+0,005	0,017668	7,006402
2	0,261+0,011	0,040508	15,52036
3	0,237+0,006	0,023551	9,916092
4	0,239+0,011	0,038839	16,21095

При капельном внесении МПБ коэффициент вариации оптических плотностей Cv варьировал от 7 до 16,2%. Дополнительное воздействие на варьирование оптических плотностей мог оказывать «краевой эффект» - испарение части МПБ в краевых зонах планшет. Тем не менее, статистически достоверных отличий оптических плотностей МПБ в разных повторностях обнаружено не было (см. табл.№7).

Таблица№ 8. Воспроизводимость усредненных результатов оценки антибиотикорезистентности к 11 антибиотикам
№ эксперимента	M	Квадратическое отклонение	Cv	m
1	0,703333	0,304171	43,24712	0,087911
2	0,725833	0,305983	42,1561	0,088434
3	0,702083	0,289999	41,30544	0,083815
4	0,687	0,287306	41,82042	0,083037

Оценка вариабельности и воспроизводимости оптических плотностей при инокуляции культуры во все лунки бактериологической петлей после однократного отбора пробы. Для этой цели инокулировали культуру E.coli во все 4 рядка лунок с разными антибиотиками после однократного взятия материала на бак. петлю из единичной колонии с твердой питательной среды. В результате исследований не было обнаружено достоверного снижения средней оптической плотности в направлении от первого рядка лунок к последнему (таблица№ 8).

Таблица 9. Воспроизводимость антибиотикограмм

	зинаприм	эриприм	рифан	апрамицин	родотиум	фуразолидон	коливет	квинабик	энроколи	амоксициллин	энрофлон	отр. контроль
M	0,96	0,56	0,96	0,24	0,82	0,88	0,24	0,24	0,90	0,86	0,88	0,85
m	0,01	0,01	0,01	0,002	0,03	0,01	0,00	0,01	0,02	0,011	0,04	0,01
Cv	1,83	5,44	3,22	2,28	8,67	4,45	2,82	5,17	5,09	2,75	10,13	4,09

При анализе воспроизводимости антибиотикограмм (оптических плотностей бактериальной культуры после 18 часовой инкубации в присутствии различных антибиотиков) значительных отклонений результатов в 4-х повторностях обнаружено не было. Коэффициент вариации оптических плотностей варьировал от 1.83% до 10.1% (таблица 9). Статистически достоверных различий средней оптической плотности лунок в рядках антибиотикограмм также не установлено (таблица 8).