Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 5 )

В процессе исследований были отработаны режимы проведения реакций позволяющие обеспечить получение воспроизводимых результатов (см. рис. 5.).

SE-1

SE-2

SE-3

STTR5

SE-7

SE-8

SE-9

Рис.5 Электрофореграмма типирования 2-х изолятов сальмонелл со всем разработанными парами праймеров.

На электрофореграмме показаны результаты VNTR- типирования с полевым изолятом S. enteritidis.

5. Определение плазмидного профиля

Рис. 6 Кластерный анализ результатов VNTR-типирования in silico известных геномов S. enterica.

Рис. 7 ПЦР с использованием праймеров фланкирующих VNTR типа GATGCCG

Рис. 8 ПЦР с использованием праймеров фланкирующих VNTR типа GTTGGTA

Голубь с кормоцеха

Бройлеры

Суточные цыплята от ПФ поставщика

Рис. 9 Результаты VNTR типирвания с системой праймеров VNTR 7 панели изолятов сальмонелл изолированных в Новосибирской области

Наглядный пример - использование результатов VNTR типирования изолятов сальмонелл, отражен на рис. На электрофореграмме видна гомология по VNTR типам у изолятов сальмонелл выделенных у голубя убитого на зерноскладе, из печени цыпленка –бройлера и от суточных цыплят родительского стада. Ввиду того, что поставщик племенной птицы находится от неблагополучной, по сальмонеллезу птицефабрики далеко, мы можем предполагать вертикальный путь заноса данного VNTR типа сальмонелл на фабрику. С другой стороны мы можем наблюдать сходство VNTR типов изолятов сальмонелл выделенных от голубя на зерноскладе, что свидетельствует о контаминации зерна голубями и высокой вероятности заражения через корм. Однако, так как голуби явно не в состоянии долететь до поставщика племенной птицы, ибо не в состоянии пересекать континенты, следует ожидать что голуби заразились от сельско-хозяйственной птицы и стали резервуаром сальмонеллеза для данной и близлежащих птицефабрик, что делает неэффективным проведение протиовэпизоотических мероприятий нацеленных на прерывание только вертикального пути заражения.

6.2 Дискриминация штаммов и изолятов с использованием метода PFGE

У сальмонелл плазмиды подразделяют с функциональной точки зрения на две группы. В первую группу входят функционально значимые плазмиды это серовароспецифические, ассоциируемые с патогенностью и антибиотикорезистентностю плазмиды размерами от 40000 до 160000 п. н. и плазмиды меньших размеров, функциональное значение которых в реализации патогенного потенциала сальмонелл не доказана [14].

Моделирование профилей макрорестрикции редкощепящими эндонуклеазами XbaI, AvrII, SfiI in silico показало что наиболее вариабельными характеристиками электрофореграммы у разных сероваров сальмонелл обладали при изучении фрагемнтов рестрикции размерами до 200 килобаз (см. рис. 9).

XbaI	AvrII
SfiI 9 часов	SfiI 20 часов

Рис. 1 Результаты PFGE in silico профилей макрорестрикции геномной ДНК различных сероваров сальмонелл при рестрикции эндонуклеазами XbaI, AvrII, SfiI,

Примечание: последовательности треков 1 agona, 2 arizonae, 3 cholerasuis, 4 dublin, 5 enteritidis, 6 gallinarum,7 heidelberg, 8 newport, 9 paratyphi A, 10 paratyphi B,11 S. enteritidis, 12 schwarzergrund, 13 неидентифицированный серовар, 14 typhiCT, 15 typhimurium

Ввиду того что, фрагменты рестрикции меньшего размера содержат меньше ДНК и, соответственно обладают меньшей светимостью, была предпринята попытка оптимизировать метод пробоподготовки ДНК с целью увеличения фракции мобильной ДНК и уменьшение ее деструкции эндогенными ДНКазами.

В итоге был подобран следующий протокол выделения:

1. Kлетки суточной культуры сальмонелл в объеме 15 мл прогревали 30 минут при 65оС, осаждали центрифугированием

2. Осадок обрабатывали лизоцимом (20ед на пробу), в буфере 0,1 ЭДТА, 0,05ТрисHCl в течение 1 часа (в объеме 200 мкл).

3. К суспензии добавляли 10 ед. протеиназы К и инкубировали в течение 2-х часов

4. К суспензии внесенной в лунки 12 луночного планшета, добавляли расплавленную SDS агарозу (1%SDS, 1% агарозы) и инкубировали в течение 3-х часов при 65 оС.

5. Планшет с пробами остужали при комнатной температуре, из пластинок агарозы скальпелем вырезали блоки толщиной не более 5мм, и переносили в пробирки с 5мл. стерильной дист. воды. инкубировали ночь при температуре 65оС

6. Воду сливали и в пробирки с агарозными блоками вносили 2М раствор гуанидина гидрохлорида и инкубировали 3 часа при комнатной температуре.

7. После удаления гуанидина, блоки промывали дист. водой однократно 1ч при комнатной температуре и, при температуре 65оС, 3-х кратно по 1-2 часа.

8. На ночь блоки оставляли в ТЕ буфере и использовали для пульс-электрофореза плазмид.

Тестирование 28 выделенных культур на наличие крупных плазмид позволило выявить наличие 12 культур содержащих плазмиду размерами ~58000п. н. и 2 культуры содержащие низкомолекулярные плазмиды ~5000п. н.

6.3 ПЦР мониторинг для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий

В исследованиях используется количественная Real-time PCR c зондом Такман разработанная в ИХБФМ СО РАН. В реакции используют праймеры со следующими нуклеотидными последовательностями: Sm1 5`GAGCATATTCGTGGAGCAATG-3` и Sm2 5`- AATAACATCCTCAACTTCAGCAG-3 и флуоресцентный зонд Sm3 Taqman FAM-TGCTCGTAATTCGCCGCCATTGG-гаситель.

Для количественного учета реакции ставят контроли с заведомо известным содержанием микроорганизмов в пробе, в количестве не менее 4-х контрольных точек.

Реакцию учитывают общепринятым методом с использованием реал-тайм амплификатора на основании калибровочных кривых, полученных с использованем стандартных образцов с различным содержанием микроорганизмов в пробе [50].

Геномную ДНК выделяют следующим образом. Одноразовыми стерильными тампонами делают соскоб содержимого клоаки. С тампонов соскоб смывают 1 мл 4М раствором гуанидинизотиоцианата. По 300 мкл. смыва переносят в пробирки Эппендорфа, тщательно перемешивают, инкубируют при 56оС в течение 5 минут и центрифугируют при 4 тыс. об./мин. в течение 3-х минут. Надосадочную жидкость переносят в другие пробирки и туда же вносили по 50 мкл ДНК сорбента (silica). Пробы тщательно перемешивают, инкубируют 5 минут, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 5 тыс. об/мин. в течение 1 минуты. Надосадочную жидкость сливают, сорбент промывают буфером для промывки, ДНК элюируют 50 мкл ТЕ буфера при 56 С.

Учитывая, что желудочно-кишечниый тракт можно рассматривать как входные ворота и место резервации сальмонеллезной инфекции, а также как один из важных органов, откуда происходит диссеминация возбудителя, мы сочли целесообразным для ПЦР-скрининга и мониторинга сальмонеллоносительства на птицефабриках, использовать клоакальные смывы. Отбор проб производят одноразовыми стерильными тампонами, метод отбора позволяет проводить прижизненную диагностику и сводит риск перекрестной контаминации к минимуму [49].

С целью оценки эффективности антибиотикотерапии, проводят отбор биоматериала непосредственно до обработки антибиотиком и сразу после отмены курса антибиотикотерапии. Курсы антибиотикотерапии проводят в соответствии с рекомендациями производителя антибиотика.

Инфицированность клоакальных смывов от кур родительских стад до и после обработки антибиотиками, по результатам ПЦР, %

группа	антибиотик	Размеры выборки	% инфицированности
1	До обработки	10	20
2	До обработки	10	30
3	До обработки	10	20
4	До обработки	21	19,04
1	Флубактин	10	0
2	Энроксил	10	0
3	Энроксил	10	10
4	Эгоцин	21	0

Как следует из таблицы №1, уровень инфицированности клоаки птицы родительских стад варьировал от 19% до 30%. Данный метод оказался удобен для подбора эффективных препаратов позволяющих контролировать сальмонеллоносительство. Например, неожиданно удачным оказался эксперимент с флубактином, так после обработки этим препаратом все пробы были отрицательны в ПЦР на наличие ДНК сальмонеллы (см. табл. 12).

Помимо инфицированности на популяционном уровне, с помощью real-time ПЦР (см. рис.10), нами была оценена инфекционная нагрузка сальмонеллами инфицированной птицы.

Рис. 10 кривые накопления ПЦР продукта

во взаимосвязи с количеством сальмонелл в пробе

Так до обработки эгоцином инфекционная нагрузка варьировала от 1,4 тыс. до 558 млн. микроорганизмов на пробу. Через семь дней после окончания обработки у единственной инфицированной птицы инфекционная нагрузка несколько выросла до 2,8 млрд. сальмонелл на пробу. Можно предполагать что это было обусловлено эффектом постантибиотического дисбактериоза, либо снижением колонизационной резистентности кишечника за счет уменьшения активности клеточного конвейера (по нашим данным антибиотики тетрациклинового ряда оказывают такое дейстиве на стенку кишечника). Тем не менее, для взрослой птицы со сформированной микрофлорой кишечника данная ситуация вполне безопасна.

Обобщая данные по результатам экспериментов с эгоцином, можно предложить использовать эгоцин в первую очередь в период предшествующий переводу и в начале яйцекладки. Для молодой птицы в возрасте до 30 дней важно использование препаратов снижающих количество сальмонелл в кишечном содержимом (эгоцин, как следует из наших исследований, к этой группе отнести нельзя). После завершения формирования желудочно-кишечного тракта становиться более актуальным снижение процента инфицированной птицы, с этой задачей эгоцин справился т. к. увеличение процента инфицированности в долгосрочном периоде не наблюдается (по сравнению с птицей не обработанной эгоцином).

7.Методические подходы, для контроля сальмонеллезов, на птицефабрике

Существуют разные принципы, на основе которых разрабатывают системы контроля сальмонеллезов на сельскохозяйственных предприятиях.

«Концепция нулевого риска», наиболее активно позиционируется медицинскими работниками, стремящимися свести риск заражения человека сальмонеллами через животноводческую продукцию к нулю. Вероятно, наиболее последовательная попытка реализации этой концепции, была предпринята в Дании. Система противо-сальмонеллезных мероприятий в Дании построена на обнаружении неблагополучных по сальмонеллезам стад на основе массового микробиологического и серологического мониторинга и уничтожения этих стад (птица из неблагополучных птицефабрик забивается на отдельных сан. бойнях, подвергается температурной обработке). Наиболее важным элементом этой программы мероприятий, является обеспечение птицефабрик и фермерских хозяйств неинфицированной птицей. Для достижения этой цели жесткому микробиологическому контролю подвергаются родительские (племенные) стада и ремонтный молодняк. При этом, запрещены вакцинопрофилактика сальмонеллезов, лечение зараженной сальмонеллами птицы с помощью антибиотиков. Также, важным моментом предотвращения заноса сальмонелл на птицефабрику, является микробиологический контроль поступающих кормов.

В результате реализации комплекса противоэпизоотических мероприятий Дания находится в числе стран с самым низким уровнем зараженности сальмонеллами продукции птицеводства и животноводства. Количество неблагополучных по сальмонеллезу хозяйств менее 1%.

Разберем плюсы и минусы данной системы с учетом особенностей птицеводства в РФ.

На момент начала программы противосальмонеллезных мероприятий Дания уже входила в группу стран Европы с самым низким уровнем инфицированности стад птицы и свиней. Однако в большинстве стран доля неблагополучных по сальмонеллезу хозяйств варьирует от 56 до 20%, к наиболее неблагополучным странам можно отнести Польшу, Венгрию, Болгарию. Внедрение Датской системы противосальмонеллезных мероприятий для таких стран грозило бы потерей, соответственно, более 30-50% птицеводческих хозяйств, резким удорожанием продукции птицеводства и не гарантировало бы благополучия в будущем, так как высокая значимость вертикальных путей заражения при сальмонеллезах, требует обязательного контроля сальмонеллоносительства на племенных репродукторах и родительских стадах, то есть хозяйства, поставляющие племенную птицу должны быть либо из этой же страны, либо из страны, где принята аналогичная программа мероприятий.

К минусам следует отнести также значительные финансовые затраты (в Дании, около 25 млрд. евро), следует учесть что Дания маленькая и компактная страна, для РФ потребуется пропорционально большее количество денег.

Также следует учитывать, что Датчане не добились «нулевого риска заражения» так как не смогли полностью, тотально искоренить сальмонеллоносителство и их экономика не может обеспечивать постоянные двадцатипятимиллиардные вливания в поддержание системы противосальмонеллезных мероприятий.

К несомненным плюсам следует отнести следующие – противосальмонеллезные мероприятия нацелены не только на снижение зараженности пищевой продукции сальмонеллой, но и на снижение инфицированности животных, птиц на всех этапах технологического процесса.

Основным источником заражения птицы промышленных стад являются родительские стада, передающие возбудителя с яйцом. Поэтому первоочередная задача – искоренить сальмонеллез и сальмонеллоносительство в родительских стадах. Ветеринарные специалисты из Дании совершенно обоснованно придают этому первоочередное значение. Реализация противосальмонеллезных мероприятий на системном уровне в масштабе страны, делает возможным взять под контроль производителей племенной птицы, что делает возможным проведение противосальмонеллезных мероприятий на промышленном поголовье и пищевых производствах.

Концепция «допустимого риска». Опыт Дании подтверждает невозможность достижения нулевого уровня инфицированности животноводческой и птицеводческой продукции. Снижение риска заражения к технологически-возможному минимуму более достижимая задача, о чем свидетельствует опять таки опыт Дании. Учеными ряда стран предпринимаются попытки оценить уровни зараженности стад и птицеводческой продукции в разных странах, выявить причины, по которым отдельные хозяйства отличаются по этим показателям в лучшую или худшую сторону. Использование мониторинга зараженности сальмонеллами продуктов птицеводства и самой птицы позволяет своевременно выявлять повышение уровни зараженности до недопустимого уровня и принимать соответствующие меры. Важным фактором могло бы являться оценка эпидемической и эпизоотологической значимости обнаруженных изолятов сальмонелл, ввиду того что эта значимость варьирует в широких пределах. Например, по последним данным средний уровень инфицированности сальмонеллами тушек бройлеров в РФ составляет 32% что сопоставимо с аналогичным показа теме в Китае, Чили, Индии. Уровень инфицированности тушек бройлеров в США по разным данным варьирует от 6 до 40% в разных штатах. С одной стороны, показатель весьма высок, с другой стороны все вспышки сальмонеллезов у человека, связанные с употреблением птицеводческой продукции, за последние 20 лет ассоциировались исключительно с употреблением яиц и продуктов питания содержащих различные их ингредиенты.

8. Бактериологические методы изоляции возбудителя

Обращает на себя внимание различная эффективность различных микробиологических методов выделения и первичной типизации сальмонелл. Так, при использовании следующей схемы: пептонная вода, селенитовый бульон, висмут-сульфитагар из желудочно-кишечного тракта и проб печени преимущественно изолировали P.vulgaris (64%), P.mirabilis (12%), микроорганизмы рода Enterobacter 13% Pseudomonas (4%), и в остальных случаях Salmonella enterica (в среднем 7%, в кишечнике 1%). При этом высеваемость сальмонелл из проб печени была выше, чем из проб кишечного содержимого, что парадоксально т. к. кишечник является воротами инфекции и должен быть основным источником сальмонелл.

Очевидно, что наиболее негативным фактором, снижающим чувствительность данной схемы выделения, являлась возможность роста на используемых средах других бактерий сем. Enterobacteriaceae напр. рода Proteus, Enterobacter. В то же время использование методов ПЦР позволяло выявить более высокую инфицированность проб кишечного содержимого (таблица 13), тогда как, по результатам микробиологического метода инфицированность кишечного содержимого не превышала 1%.