Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 4 )

В ходе исследований была установлена оптимальная воспроизводимость и достаточная надежность следующего протокола методики:

1. Обжечь горлышко и резиновую пробку флакона с МПБ, а также поверхность рабочего стола. Работать стерильном боксе, с соблюдением правил асептики! Оптимальным является дополнительное использование минибокса и рециркулятора воздуха.

2. В планшету с заранее внесенными антибиотиками с помощью одноразового стерильного шприца набрать через пробку из флакона МПБ

3. Отсоединить шприц от иглы и по каплям вносить МПБ поочередно в лунки планшета раскапывая среду до объема приблизительно равного 400 мкл (мениск жидкости должен быть вогнутым), не следует допускать струйного внесения среды (в этом случае при примерно идентичном уровне МПБ в лунках, количество капель будет одинаково, а точность внесения - выше).

4. Бактериальной петлей произвести отбор культуры с поверхности твердой питательной среды и, быстро погружая петлю в лунки, произвести инокуляцию культуры во все лунки рядка

5. Заполнить остальные лунки планшета инокулируя по одной культуре на рядок лунок

6. Закрыть планшет стерильной крышкой или другим стерильным планшетом

7. Инкубировать при 37оС 16-18ч.

8.Произвести измерение оптических плотностей на вертикальном планшетном спектрофотометре с использованием светофильтра 530 – 550 нм

9. Импортировать данные в компьютер и обработать с использованием специализированного программного обеспечения.

Протокол анализа антибиотикорезистентности микроорганизмов в ИФА формате, адаптированный для прикладных исследований, характеризуется достаточной воспроизводимостью и надежностью. Технология изготовления комплекта планшет и реактивов обеспечивает получение стерильных компонентов с минимальным разбросом технических характеристик. Использование шприцев для внесения питательных сред позволяет уменьшить риск контаминации лунок посторонней микрофлорой в призводственных условиях. Инокуляция материала в рядок после однократного отбора обеспечивает достаточную надежность, высокую производительность труда и уменьшает риск контаминации за счет уменьшения времени работы с планшетом.

Микропланшетный метод определения антибиотикорезистентности сальмонелл с резазурином.

Принцип метода заключается в том, что краситель резазурин при наличии роста бактерии меняет цвет питательной среды с синего на розовый.

Протокол метода определения антибиотикорезистентности:

Таблица 10: концентрации антибиотиков в лунках микропланшета.

№ п/п	антибиотик	Концентрация, мкг/мл
1	Цефтриаксон	16
2	Канамицин	16
3	Метронидазол	5
4	Рифампицин	16
5	Гентамицин	16
6	Ампициллин	16
7	Цефотаксим	16
8	Амикацин	10
9	Стрептомицин	10
10	Бензилпенициллин	16
11	Амоксициллин	16
12	Контроль	0

Тестируемые культуры заранее ресуспендируют в пробирках с питательной средой (4 мл), для этого в пробирку бактериологической петлей вносят 1-2 петли бактерий с твердой питательной среды, либо 100-200 мкл культуры выращенной на жидкой питательной среде.

В микропланшет с предварительно внесенными антибиотиками (таблица 10), и резазурином (по 10 мкл рабочего раствора на лунку) вносят питательную среду – бульон Хоттингера с предварительно внесенными в нее бактериями. Одна культура бактерий высевается на один горизонтальный ряд микропланшета в количестве по 200 мкл. на лунку. Микропланшет закрывается крышкой и помещается в термостат при 37С на 16-18 часов.

Учет результатов проводят анализируя подавление антибиотиком изменение цвета резазурина с синего на розовый.

6. Молекулярная эпизоотология

6.1 VNTR типрирование

За последние годы были полностью отсеквенированы геномы многих бактерий, в том числе бактерий, патогенных для человека. При анализе секвенированных геномов было обнаружено, что значительная часть ДНК содержит повторяющиеся последовательности. Повторы отличаются по размеру, расположению, сложности и подразделяются на классы, такие как прямые повторы, двойные повторы, инвертированные повторы. Полиморфные микросателлиты обычно упоминаются как варьирующие по числу тандемные повторы (VNTR, variable number tandem repeats). Известно, что кластеры повторов могут служить мишенями для рекомбинации или сдвигов ДНК-полимеразы, что приводит к изменению числа повторов. Если такие события происходят с достаточной частотой, это приводит к появлению различий по данному локусу повторов между разными штаммами. Перестройки в повторённых участках ДНК также помогают микроорганизмам осуществлять быстрые геномные и фенотипические изменения. Такие изменения содержат механизмы регуляции генов или появления новых копий генов, кодирующих разнообразные поверхностные белки, что приводит к антигенному сдвигу и позволяет бактерии избежать иммунной системы хозяина.

В последние годы во многих работах тандемные повторы ДНК стали использоваться как средство для идентификации бактериальных штаммов. Многие патогенные бактерии генетически гомогенны, что, вероятно, отражает их быстрое распространение и успех в качестве патогенов млекопитающих. Мультилокусный анализ VNTR стал хорошим методом изучения генетического разнообразия высоко мономорфных видов, таких как Bacillus anthracis и Yersinia pestis. На настоящий момент осуществляется разработка методов типирования других бактерий, патогенных для человека, например, Escherichia coli и сероваров Salmonella, поскольку эти бактерии имеют огромное значение для здравоохранения.

Для типирования используют 7 пар праймеров предложенных нами, предварительное моделирование результатов VNTR- типирования на полногеномных последовательностях сальмонелл, показало что для достоверной дискриминации всех представителей исследуемой выборки, требуется 7 пар праймеров (см. табл.11).

Таблица 11. Результаты VNTR типирования in silico известных геномов S. enterica

Название серотипа	Пары праймеров
SE-1	SE-2	SE-3	STTR5	SE-7	SE-8	SE-9
S. enterica subsp. enterica serovar Agona str. SL483	-	-	-	108 bp	1329 bp	465 bp	320 bp
S. enterica subsp. arizonae serovar 62z4,z23-	-	-	-	135 bp	-	-	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis str. SC-B67	-	-	-	162 bp	475 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Dublin str. CT_	253 bp	201 bp	308 bp	168 bp	353 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str. P125109	267 bp	208 bp	308 bp	132 bp	719 bp	467 bp	329 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Gallinarum str. 287/91	295 bp	194 bp	308 bp	-	354 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Heidelberg str. SL476	-	-	-	168 bp	1865 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Newport str. SL254	-	-	-	108 bp	1805 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150	246 bp	-	-	108 bp	524 bp	468 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B str. SPB7	-	-	-	150 bp	-	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Schwarzengrund str. CVM 19633	-	-	-	132 bp	951 bp	466 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18	246 bp			144 bp	576 bp	465 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar typhimurium LT2	-	-	-	150 bp	1739 bp	467 bp	320 bp
S. enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2	245 bp	-	-	156 bp	611 bp	465 bp	320 bp

Как следует из таблицы, совокупная дискриминационная способность метода формируется из наличия и отсутствия реакции – пары праймеров SE-1, 2, 3 так и размеров ампликонов – пары праймеров STTR5, SE-7, SE-1. Высоко-консервативные локусы фланкированные парами праймеров SE-8,9 представляют ценность в качестве прохождения внутреннего контроля реакции. Таким образом, мультилокусный анализ включает в себя VNTR типирование как высоковариабельных так и низковариабельных участков генома сальмонелл, что в перспективе позволит оценивать изоляты сальмонелл с различным уровнем генетических различий (рис. №№5-8).