Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 6 )

Таблица 13. Скрининг четырех птицефабрик Сибирского региона на носительство сальмонелл по результатам ПЦР.

тип стада	возраст птицы	выборка	материал	процент положительных проб
Бройлеры	15дн	6 проб	клоака	33,3%
Бройлеры до обработки флубактином	21дн	5+5 проб 2 разных корпуса	клоака	50%
Бройлеры после обработки флубактином	28 дн	4+4 проб 2 разных корпуса	клоака	0%
Родительское стадо	170дн	8 проб	клоака	0%
несушка	195дн	10 проб	клоака	0%

Как следует из таблицы №13, уровень инфицированности по данным ПЦР анализа варьировал от 0 до 50%.

Недостатком традиционной схемы изоляции сальмонелл является тот факт что и селенитовый бульон и висмут-сульфитагар селективны в отношении грамм-отрицательных микроорганизмов активно продуцирующих сероводород (при этом посевная доза таких микроорганизмов должна быть высокой чтобы обеспечить подавление селектирующего агента). Соответственно высокая концентрация в пробе микроорганизмов рода Proteus защищает другие микроорганизмы путем редукции сульфитов до сероводорода.

Более эффективна была первичная изоляция на среде Эндо, при этом посевная доза сальмонелл может варьировать до единичных бактериальных клеток и этот фактор не влияет на выживаемость сальмонелл в данной среде. Однако при исследовании желудочно-кишечного тракта птиц данный метод оставался недостаточно эффективным ввиду возможности ползущего роста P.vulgaris по среде Эндо (данный микроорганизм всегда встречается в кишечном содержимом птиц).

Использование среды XLT4 позволило исключить негативное влияние микроорганизмов рода Proteus на рост сальмонелл при их первичной изоляции. При тестировании 34 проб кишечного содержимого на среде XLT4 было выделено 12 культур сальмонелл и ни одной культуры микроорганизмов рода Proteus. Схема изоляции была следующей; посев на среду Эндо на 16 ч, рассев бледно-розовых колоний на среде XLT4 инкубация 24-48 ч, посев штрихом на среды висмут-сульфитагар и уриселект-4 (для подтверждения продукции сероводорода и исключения триптофандезаминазной активности соответственно). В дальнейшем изоляты обладающие культуральными и тинкториальными характеристиками сальмонелл типировали иммунохимически, биохимически или ПЦР.

Таблица 14 Сопоставление результатов детекции сальмонелл из толстого отдела кишечника цыплят-бролйеров

Схема выделения 1 Кол-во выделенных культур	Схема выделения 2 Кол-во выделенных культур	ПЦР Кол-во положительных реакций
0	12	14

Как следует из таблицы 2 сопоставление традиционной схемы выделения (схема 1) и предложенной нами (схема 2) а также результатов ПЦР анализа показывает более высокую чувствительность предложенной нами схемы, сопоставимую с результатами ПЦР.

Схема изоляции сальмонелл из клоакальных смывов и продукции птицеводства:

Соскоб клоаки или кишечное содержимое сеют на пептонную воду и инкубируют при 37оС 3-5часов. Пробы продуктов птицеводства (смывы с поверхности тушек, кусочки фарша (25 гр.), кусочки мяса, смыв со скорлупы яйца) сеют на пептонную воду и также инкубируют 3-5 часов при 37 оС.

Пересев в соотношении 1:10 осуществляют в пробирки Эппендорфа с селенитовым бульоном и тергитолом-4, инкубируют до суток, в случае появления оранжевого окрашивания и/или осадка, делают рассев на среде Эндо. При появлении бледно-розовых колоний осуществляют параллельные пересевы на висмут-сульфит/агар или XLT-4, среду Уриселект-4 и среду Хоттингера или TCS-агар для последующей биохимической и иммунохимической идентификации в случае, если на среде XLT-4 образуются колонии с черным пигментом, без пожелтения среды, на среде уриселект-4 колонии синего или красного цвета. Используемая схема выделения сальмонелл позволяет дать отрицательный ответ в течение полутора суток (при отсутствии роста на селенитовом бульоне с тергитолом), или положительный ответ в течение 3-х суток.

9. Серологический мониторинг сальмонеллоносительства

Серомониторинг следует считать более чувствительным методом позволяющим выявлять инфицированность стад птицы сальмонеллами. Связано это с тем, что локализация сальмонелл в организме может быть неравномерной, и при отборе материала существует вероятность отобрать образец не содержащий сальмонелл. В то же время, контакт антигенов сальмонелл с иммунной системой организма приводит к образованию антител, вне зависимости от места локализации возбудителя. Использование иммуноферментного анализа имеет определенные ограничения, связанные как с видоспецифичностью конъюгата, так и с высоким риском перекрестных реакций на неродственные антигены микроорганизмов другого вида. В этом аспекте реакция агглютинации имеет такие преимущества как универсальность, а низкая чувствительность реакции снижает вероятность неспецифического реагирования.

Для повышения производительности метода мы разработали флюоресцентный вариант РА с корпускулярным сальмонеллезным О антигеном. Преимуществом метода является возможность приготовления антигена из местного штамма S.enterica выделенного из патологического материала.

Для проведения РА требуются следующие компоненты:

1. Инактивированный нагреванием корпускулярный антиген S.enterica меченный бромистым этидием, 2х

2. Фосфатно-солевой буфер с рН 7,0-7,2

3. 96 луночные микропланшеты с V-образным дном

4. Трансиллюминатор с системой видеодокументирования

5. Многоканальные пипетки с диапазоном дозирования 50-250мкл

6. Ванночки

7. Одноканальные пипетки с диапазоном дозирования 20-200мкл

Реакция ставиться следующим образом:

1. Во все лунки микропланшетов вносят по 100 мкл фосфатно-солевого буфера.

2. В первый горизонтальный ряд, отдельными наконечниками вносят по 25 мкл сыворотки и перемешивают

3. Многоканальной пипеткой из первого ряда лунок отбирают 100 мкл сыворотки и переносят во второй ряд лунок. Таким образом, меняя носики, титруют сыворотку с шагом 1:2.

4. В лунки вносят по 100 мкл флюоресцентно - меченного антигена и инкубируют от 4-х до 18 часов.

5. Микропланшет фотографируют в ультрафиолетовых лучах, с использованием трансиллюминатора.

6. При наличии положительной реакции образуется «зонтик», в случае отрицательной реакции, бактериальные клетки скапливаются на дне лунок, в виде «пуговки», которая выглядит более ярко светящейся точкой на общем фоне (см. рис. 11).

7. Определяют титр тестируемой сыворотки на котором сохранилась агглютинация.

Рис. 11 Результаты РА с флюоресцентно меченным антигеном.

10. Методические подходы к снижению реинфекции и рецидивирования сальмонеллоносительства

Серьезной проблемой является повторное инфицирование птицы после отмены курса антибиотикотерапии. Мы неоднократно сталкивались с ситуациями, когда антибиотик очень хорошо подавлял патогенную флору в организме птицы, но после его отмены инфекция вспыхивала с новой силой. Обычно это обусловлено тем, что птица в состоянии постантибиотического дисбактериоза отличается высокой восприимчивостью к заражению, при этом наиболее патогенные формы бактерий заселяют организм птицы одними из первых. Основной источник реинфицирования в напольных птичниках это, естественно, подстилка. Длительность переживания E.coli в подстилке варьирует от 4 до 20 дней, Salmonella нередко существует в подстилке длительное время. В связи с этим мы можем предложить 2 технологии эмпирического подбора антибиотиков.

1. При ПЦР-мониторинге курса антибиотикотерапии мы стараемся оценивать эффективность антибиотика не только в краткосрочном, но и отдаленном периоде. Например, наши исследования показывают достаточно высокую эффективность эгоцина применяемом с целью снижения обсемененоости птицы родительского стада сальмонеллами.

2. Важным фактором, определяющим риск реинфекции является вероятность дисбактериоза. Наши исследования показывают, что не все антибиотики вызывают постантибиотический дисбактериоз, устойчивость нормофлоры к антибиотикам на разных птицефабриках варьирует, но есть и определенные закономерности. Например, по нашим данным, стабильном инимальное снижение концентрации лактобактерий наблюдается при использовании фуразолидона, колистина и гентамицина. Фторхинолоны (энроксил, флубактин) способны повреждать лактофлору примерно в 50% случаев. Такие антибиотики как тилозин, амоксициллин, спектиномицин, клиндамицин, линкомицин и левомицетин в большинстве случаев вызывают постантибиотический дисбактериоз. Соответственно можно рекомендовать проведение хотя-бы однократной оценки антибиотикорезистентности лактофлоры, существующей на конкретной птицефабрике. Суть технологии заключается в преимущественном использовании антибиотиков активных в отношении патогенных микроорганизмов, но не повреждающих, при этом нормофлору птицы.

11. Эпизоотологические методы борьбы с антибиотикорезистентностью

Законы распространения антибиотикорезистентности вполне подчиняются принципам эпизоотологии, и методы профилактики этого явления в принципе аналогичны. Поэтому, качественная дезинфекция, качественная мойка птичников, дезинфекция в присутствии птицы имеют значение и здесь. Отличительными особенностями является возможность передачи генов устойчивости к антибиотикам от одного вида к другому, и ферментативные механизмы защиты от позволяющих защищать от антибиотика всю микрофлору в целом.

Поэтому важно не допускать повторное использование одного и того же антибиотика на одном технологическом цикле, полезно иметь схему ротации антибиотиков и заранее формировать группу антибиотиков запаса.

Также следует учитывать занос антибиотикорезистентных штаммов из раодителского стада, для минимизации ущерба от этого явления следует на родителях и промышленном стаде использовать различные антибиотики, уделять больше внимания бактериальным инфекциям передающимся с яйцом (сальмонеллы, псевдомонасы, протеи и т. д.).

12. Повышение эффективности антибиотикотерапии

Разработка и использование челночных схем. В течение одного курса, например 5 дней, первые 2 дня назначается один антибиотик, последующие 3 дня используется другой антибиотик. Так как процесс адаптации бактерий занимает некоторое время (от нескольких часов, до нескольких суток) то челночная схема позволяет выдержать необходимую длительность курса и при этом, микрофлора может не успеть адаптироваться. В идеале, можно добиться того, что антибиотик №1 подавляет микрофлору способную разрушить антибиотик №2, либо снизить к нему устойчивость. Мы этот процесс называем последовательным синергизмом. Естественно подбор челночных схем необходимо проводить с использованием специальных тестов на перекрестную антибиотикорезистентность.

Обеспечение адекватных доз – назначение заниженных концентраций это верный путь к возникновению устойчивости к антибиотику. Поэтому большой проблемой являеться фальсификация препаратов, снижение концентрации действующего вещества и т. д. Мы предлагаем вводит на птицефабрике самостоятельный контроль качества покупаемого препарата. Для этого необходимо хранить в морозилке растворы антибиотиков в которых вы уверенны (эталоны). При покупке новой партии следует отобрать пробу и развести до такой же концентрации как и в эталонных образцах. После этого на чашку Петри следует посеять газоном чувствительную к антибиотику культуру. На поверхности агара нагретым стеклянным стержнем выплавить лунки, или положить диски из вильтровальной бумаги. Затем необходимо с помощью автоматической пипетки внести в лунки расположенные друг от друга на расстоянии не менее 2-х см. точно по 10 мкл. проб антибиотиков. Если, после инкубации в термостате зона задержки купленного препарата будет меньше чем у эталонного образца, следует ставить вопрос о целесообразности дальнейших закупок у этой фирмы, либо направить образец антибиотика в ВГНКИ для дальнейших судебных разбирательств.

13. Постантибиотические дисбактериозы как фактор реинфицирования.

Как следует из таблиц №№ 15 и 16 постантибиотические дисбактериозы могут быть фактором определяющим риск реинфицирования сальмонеллами. В таблице 15 можно подобрать антибиотики пригодные для построения челночных схем антибиотикотерапии сальмонеллезов, либо снижения риска реинфекции при монотерапии одним антибактериальным препаратом.

Таблица 15. Чувствительность лактобактерий к антибиотикам

Таблица 16. Уровни инфицированности сальмонеллами бройлеров при различной концентрации лактобактерий в толстом отделе кишечника по результатам ПЦР

Примечание: ПЦР на микроорганизмы рода Salmonella

(+ положительная реакция, - отрицательная реакция),

ГЕ/гр. – количественная ПЦР на микроорганизмы рода

Lactobacillus в геномных эквивалентах на 100мг фекалий (аналог КОЕ).

12. Изучение радиорезистентности сальмонелл

Использование методов стерилизации пищевой продукции может являться важным фактором, позволяющим значительно повысить безопасность продуктов животноводства и снизить риск заражения населения сальмонеллами и рядом других микроорганизмов способных вызывать пищевые токсикоинфекции. Наиболее широко используется стерилизация гамма-излучением, однако, этот способ требует надежного экранирования технологических помещений и небезопасен для персонала, также у этого метода достаточно низкая энергоэффективность. Обработка бета-лучами существенно дешевле, затраты энергии меньше, ввиду низкой проникающей способности бета-частиц, затраты на экранирование технологических помещений существенно ниже. К недостаткам этого способа является незначительная толщина зоны стерилизации. Эффективная глубина стерилизации мясопродуктов, как правило не превышает 1 см. В то же время, основное количество изолятов сальмонелл из мясо-продуктов, выделяется с поверхности тушек птиц и свиней, бактериальная контаминация мясопродуктов обычно имеет экзогенный характер, таким образом, поверхностная стерилизация субпродуктов и мясопродуктов представляется довольно перспективным направлением. Для жидких продуктов и фарша представляется реальной тотальная стерилизация в процессе перекачки этих субстанций по трубочкам диаметром не более 1-2 см. при этом процесс стерилизации каждой новой порции продукта занимает доли секунды.

В связи с этим представляет интерес оценка факторов влияющих на эффективность радиационнной стерилизации.

Для анализа биологических эффектов вызываемых различными дозами бета-частиц создавали градиент излучения. Градиент ионизирующего излучения (около 10 раз на см) создавался за счет рассеяния пучка электронов на титановой фольге. При этом, возникает поперечная компонента скорости электронов (явление открытое Резерфордом), при этом, пропорционально удалению от оси пучка, происходит уменьшение дозы электронов. Для оценки линейности градиента использовали пластину содержащую химические компоненты темнеющие под воздействием ионизирующего излучения пропорционально дозе.

Рис. 12 Линейность градиента оценена по градиенту потемнения dosimetric plate (на графике отражено изменение светимости за счет гашения аутофлюоресценции дозиметрической пластины пропорционально дозе излучения).

Как следует из рис 12, предложенным нами способом можно создать участок градиента с линейностью достаточной для проведения исследований, на участке градиента используемого нами для исследований. Корелляция между расстоянием от оси пучка и светимостью аутофлюоресценции пластины составляла k=-0.99.

Для тестирования изменения антибиотикорезистентности бактерий, под воздействием градиента доз ионизирующего излучения, на прямоугольную чашку с агаром TCS газоном сеяли S.enterica. На чашку рядками вдоль продольной оси раскладывали диски с антибиотиками на расстоянии друг от друга не менее 3 см. Чашку инкубировали при комнатной температуре 2 ч и облучали электронами (см. выше) так, чтобы направление градиента дозы электронов совпадало с продольной осью чашки. После облучения бактерии инкубировали при 37оС 18ч.

Рис. 13 Изменение размеров зон задержки роста к энрофлоксацину, гентамицину и доксициклину S. paratiphi A под воздействием градиента ионизирующего излучения.

Из рис. 15 следует, что воздействие ионизирующего излучения на S.paratyphi A сопровождалось увеличением зоны задержки роста к антибиотику тетрациклинового ряда – доксициклину и представителю группы фторхинолоновых антибиотиков (энрофлоксацину). Однако, у другого штамма S. dublin (штамм гусь 09) наблюдается уменьшение зоны задержки роста к доксициклину, более того, отмечается значительный рост устойчивости сальмонелл к ионизирующему излучению в участках прилегающих к дискам с доксициклином. По нашему мнению этот феномен может быть обусловлен тем, что антибиотики тетрациклинового ряда тормозят деление клеток и синтез ДНК, в то время как ионизирующее излучение наиболее опасно для активно пролиферирующих клеток.

а) б)

Рис. 15 Изменение размеров и формы зон задержки роста S. dublin (штамм гусь 06) к гентамицину.

Примечание: а) наибольшая доза излучения б) наименьшая доза излучения

Нами было сделано предположение, что градиент ионизирующего излучения может менять не только размер зон задержки роста, но и форму зоны задержки роста, в случае если микроорганизм изменяет свои биологические свойства даже при небольших изменениях дозы ионизирующего излучения. На рис. 3 мы видим, что устойчивость к гентамицину S. dublin (штамм гусь 06) не только возрастала, но и форма зоны задержки роста была изменена, т. е. мы наблюдаем эксцентричность зоны относительно диска с антибиотиком. Из гипотезы предложенной нами следует что, зоны задержки роста должны последовательно уменьшаться или увеличиваться в направлении роста дозы, при этом расстояние противоположных краев деформированной зоны задержки роста, по оси градиента ионизирующего излучения, от центра диска с антибиотиком должно изменяться в том же направлении.

D1>D2>Dn (при увеличении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения)

или D1<D2<Dn (при уменьшении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) где S – диаметр зоны задержки роста к дискам с антибиотиками расположенным продольно оси градиента ионизирующего излучения r1>r2 (при увеличении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) r1<r2 (при уменьшении антибиотикорезистентности по мере роста дозы излучения) где r1 - расстояние от центра диска с антибиотиком до границы зоны задержки роста по оси градиента ионизирующего излучения в направлении меньшей дозы, r2 - расстояние от центра диска с антибиотиком до границы зоны задержки роста по оси градиента ионизирующего излучения в направлении большей дозы