Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 7 )

Рис.14 Графическая зависимость между величиной зоны задержки роста S.enterica и дозой излучения.

Принцип, заложенный в основу метода предложенного нами перекликается с фенотипическим анализом метало-бетта лактамаз методом «двойных дисков». В этом методе также создается градиент фактора подавляющего адаптивные возможности бактерии к повреждающему действию антибиотика, вследствие чего происходит увеличение площади зоны задержки роста в сторону диска содержащего ингибитор металло-бетта лактамаз.

Зафиксированные нами изменения свидетельствуют о влиянии антибиотиков на антибиотикорезистентность сальмонелл, что может иметь значение при радиационной стерилизации пищевой продукции и обеззараживания отходов сельскохозяйственного производства. Помимо этого, случаи повышения чувствительности отдельных штаммов сальмонелл к гентамицину, энрофлоксацину и доксициклину свидетельствует о наличии общих механизмов повреждения бактериальной клетки при воздействии ионизирующего излучения и вышеперечисленных антибиотиков, либо нарушении механизмов адаптации.

15. Фаготипирование изолятов сальмонелл

Материалы и методы: Для фаготипирования используют типовые штаммы S. enterica, S. enterica и штаммы бактериофагов под коллекционными номерами: 7, 17, 23, 24, 25, 102, 103, 104, 105, 106 из коллекции лаборатории микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины.

В качестве твердых питательных сред использовали СПА, содержащий 1,5 %-ного агара (г. Махачкала, Россия). 0,7 %-ный агар (Difco, USA), среды стерилизовали автоклавированием. Бактерии ресуспендируют в 0,9 % NaCI. Для кратковременного хранения бактериальных культур при 6 0С используют чашки Петри с твердой питательной средой. Для длительного хранения при – 70 0С в жидкую среду с бактериальной культурой добавляют глицерин до конечной концентрации 15 %. Бактериофаги хранят при – 15 0С. Для выращивания и титрования бактериофага используют стандартный метод агаровых слоев описанный (А. Грациа, 1936)

Техника фаготипирования:

Первый этап выявления фагочувствительности бактерий поводят быстрым скринингом бактериофагов: к расплавленному и остывшему до 45-46 0С (0,7 %-ного) голодного агара, добавляли 0,1 мл «ночной» бульонной культуры исследуемого штамма бактерии и наносили на плотную питательную среду. После застывания верхнего слоя, на газон бактериальных клеток наносят исследуемые бактериофаги по 5 мкл. Через 18 часов при 37 0С на поверхности твердой среды бактерий образуют равномерный мутный газон (сплошной рост) бактериальной культуры. В местах, где клетки бактерий оказались чувствительны к бактериофагу, возникают прозрачные зоны лизиса - негативные бляшки (стерильные пятна).

Второй этап:

Бактериофаги, обладавшие литическим действием, исследуют на эффективность размножения путем титрования. Титрование проводят десятикратным разбавлением препарата содержащего бактериофаг в 0,9 % NaCI. При титровании, определенное количество бактериофага вносят вместе с «ночной» бульонной культурой исследуемого штамма бактерии в остывший до 45 – 46 0С полужидкий агар, перемешивали и равномерно наносили на питательный питательный 1,5 %-ный агар. Рис. 17 Количество разведений зависит от предполагаемой концентрации фаговых частиц в образце.

Рис. 17.

Титрование бактериофага

3 2 1
	1. Контроль – сплошной газон бактериальной культуры 2. Негативные колонии бактериофага в седьмом разведении 3. Негативные колонии бактериофага в шестом разведении

На чашке Петри подсчитывают число колоний и умножают на количество разведений. Концентрацию фаговых частиц выражают в бляшкообразующих еденицах (БОЕ/ мл)

Титрование можно проводить и микро методом, представлено на Рис. 18. (а и б), что уменьшает количество чашек и расхода реактивов и материалов. На питательный агар также наносили остывший полужидкий агар с «ночной» культурой бактерий. На поверхность полужидкого (0,7 %-ного) агара наносили по 5 мкл титрованного раствора бактериофага. На рисунке 2 представлено 2 штамма бактериофага с разным диаметром негативных колоний:

а) точечные и б) диаметр 1,5 – 2 мм

Рис. 18.

Титрование бактериофага микрометодом

а)
б)

Концентрацию бактериофага подсчитывают так же, как описано выше с учетом разведения.

При исследовании штаммов сальмонелл, было выявлено 8 фаготипов взаимодействия бактериофагов с микроорганизмами, что представлено в таблице 16.

Фаготипы характерные для сальмонелл

таблица 16

	ph 7	ph 17	ph 23	ph 24	ph 25	ph 102	ph 103	ph 104	ph 105	ph 106
Фаготип I	+	-	-	+	+	+	+	+	+	-
Фаготип II	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Фаготип III	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+
Фаготип IV	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+
Фаготип V	-	-	+	+	+	-	-	+	-	+
Фаготип VI	+	+	+	+	+	+	+	-	+	-
Фаготип VII	-	-	-	+	+	-	-	+	-	+
Фаготип VIII	+	+	-	+	+	+	+	-	+	-

Заключение: Изменения эпидемиологических и эпизоотологических особенностей сальмонеллезов у человека и животных, сопровождающихся ростом инцидентности, появление новых технологий диагностики и профилактики, требует радикального пересмотра существующих средств контроля сальмонеллеза на всех этапах производства пищевой продукции.

Литература

1- , , и , , . «Кишечные инфекции. Предэпидемическая диагностика и профилактика госпитального сальмонеллеза. Методические указания М. У. № 3.1.1.» Издание официальное. Центр госсанэпиднадзора в Приморском крае Владивосток 2001 С.24

2- , , . Кишечные инфекции. Внекишечные проявления сальмонеллезной инфекции. Методические указания М. У. № 3.1.1.0-28-04.Издание официальное. Центр Госсанэпиднадзора в Приморском крае. г.

3- Aguado J. M., Ramos J. M., Garciacorbeira P., Ales J. M., Fernandez-Guerrero M. L., Soriano F. Clinical spectrum of focal infection by Salmonella no-typhi. // Medicina Clinica, 1994, Vol. 103, P. 293-298.

4- Fukuda, M., and F. Egami. 1971. A reinvestigation of the anomeric configuration of mannose in the antigens of Salmonella groups B, D and E. Eur. J. Biochem. 20:438-441

5- Hellerqvist, C. G., B. Lindberg, A. Pilotti, and A. A. Lindberg. 1970. Structural studies on the O-specific side-chains of the cell-wall lipopolysaccharide from Salmonella strasbourg. Acta Chem. Scand. 24:

6- Hellerqvist, C. G., B. Lindberg, S. Svensson, T. Holme, and A. A. Lindberg. 1969. Structural studies on the O-specific side chain of the cell wall lipopolysaccharide from Salmonella typhi and Salmonella enteritidis. Acta Chem. Scand. 23:

7- Kauffmann, F. 1975. . Classification of bacteria. Munksgaard, Copenhagen, Denmark.