Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 2 )

Таблица 3. Размеры серотипоспецифических плазмид вирулентности

Серовар	Размер, п. н.
S. gallinarum S. typhimurium S. enteritidis S. choleraesuis	88230 93939 59372 49504

Помимо плазмид вирулентности встречаются крупные плазмиды до 200 килобаз. К таким плазмидам можно отнести группу коньюгативных плазмид IncHI размером 227000п. н. обеспечивающих утилизацию лактозы [24].

Плазмида S. abortusequi, размерами около 85 kb кодирует резистентность к токсичным тяжелым металлам (серебру, хрому, кадмию и мышьяку), у этой плазмиды также обнаружен ряд генов обеспечивающих резистентность к некоторым бета-лактамным антибиотикам и утилизацию цитрата [25].

Гены устойчивости к антибиотикам у сальмонелл кодируются как в хромосоме, так и некоторых плазмидах. Как правило, гены устойчивости к антибиотикам образуют кассеты, локализующиеся внутри транспозонов которые могут переноситься из хромосомы в плазмиду и обратно, учитывая коньюгативность большинства таких плазмид, этот механизм обеспечивает распространение генов антибиотикорезистентности среди сальмонелл [26]. Наиболее широко распространен у сальмонелл интегрон класса 1 состоящий из двух последовательностей – гена int I кодирующего интегразу и гена sul1 обеспечивающего устойчивость к сульфаниламидам. Данный интегрон встречается как в первом островке патогенности хромосомы, так и в плазмидах, причем благодаря активности интегразы, между генами intI и sul1 могут встраиваться другие гены антибиотикорезистентности [27, 28].

Процесс увеличения частоты встречаемости генетических детерминант антибиотикорезистентности носит обратимый характер и при снижении селективного давления частота плазмидо-кодируемых детерминант устойчивости снижается [29]. Среди R-плазмид ответственных за антибиотикорезистентность распространена плазмида класса IncFII 140 кб. несущая гены вирулентности spvABC и rck а также гены устойчивости к тетрациклину и хлорамфениколу [28]. Сходная в функциональном аспекте плазмида S. typhimurium относящаяся к IncFIC группе плазмид кодирует гены вирулентности spvCD вместе с детерминантами резистентности обеспечивающими реализацию ACSSuT фенотипа (устойчивость к ампициллину хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаниламидам и тетрациклину) [30].

Среди функционально-значимых плазмид с низким молекулярным весом, найдено только несколько. Плазмида обеспечивающая перенос устойчивости к сульфаниламидам была описана у S. choleraesuis [31]. У S. typhi D4 мультикопийная плазмида кодирует систему рестрикции-модификации (RMS) [32]. Плазмида pWQ799 у серовара S. Borreze способна модифицировать О антиген [33]. Одной из важнейших функций низкомолекулярных плазмид кодирующих системы-модификации рестрикции может являться обеспечение фагорезистентности, в частности подобная роль показана для плазмиды pI, [14].

Таким образом, иммунохимическое и VNTR типирование сальмонелл абсолютно недостаточно для оценки патогенного потенциала полевых изолятов сальмонелл и адекватной оценки эпидемической значимости штаммов сальмонелл, обязательным условием молекулярно-эпидемиологического анализа сальмонеллезных инфекций должно являться выявление высокополиморфных хромосомных маркеров штамма и охарактеризация мобильных генетических детерминант патогенности

3.2 Выявление гена SpvC

Одним из ключевых факторов определяющих способность сальмонелл вызывать внекишечные формы сальмонеллеза у человека и животных является устойчивость к фагоцитозу.

Устойчивость сальмонелл к фагоцитозу обуславливается двумя процессами: кислотоустойчивостью и экспрессией генов Spv оперона. Продукты оперона Spv обеспечивают разрушение актина в цитоплазме клетки и таким образом предотвращают слияние фагосомы с лизосомой что и предотвращает гибель сальмонеллы внутри клетки. Таким образом, этот механизм позволяет сальмонеллам не только репродуцироватся в кишечнике, но и вызывать внекишечные инфекции.

Сальмонелл можно изолировать из различных объектов (пробы патологического материала, продукция животноводства и птицеводства, пробы кишечного содержимого). Для изоляции используют селективные и элективные среды (среда Эндо, селенитовый бульон, висмутсульфитагар). Культуры обладающие типичными для сальмонелл культуральными характеристиками дополнительно типируют на питательной среде урислелект 4 (BioRad) для исключения энтеробактеров, клебсиелл и протеев также растущих на висмутсульфитагаре. Идентификацию вида проводят с использованием биохимических тестов ПБДЭ «ДС Нижний Новгород» и real-time ПЦР.

Для выявления наличия Spv оперона у тестируемых культур используют ПЦР на ген Spv С. В реакции применяются праймеры со следующей структурой: `5-ACAGTGCTCGTTTACGACTTGAAT-3`, `5-TCACGCCCACTTCGTAGTTCA-3`. Реакцию проводят по следующей программе: линеаризация 95оС 30сек., отжиг праймеров 54оС 20сек, элонгация 72оС -40 сек, количество циклов – 40.

Результаты реакции учитывают путем электрофореза ПЦР продуктов в 6% полиакриламидном геле и после окрашивания бромистым этидием, в случае положительной реакции на электрофореграммах регистрировали ампликоны размером 553 п. н.(см. рис. 2)

916 23 24

553пн

Рис. 2. Результаты ПЦР на наличие гена SpvC

С целью повышения надежности результатов ПЦР, положительные на наличие гена SpvC пробы, следует дополнительно проверять путем рестрикции ПЦР-продукта эндонуклеазой Taq1. При этом образовывается 2 фрагмента длинной 395 и 158 п. н. (см. рис. 2)

395п. н.

158п. н.

Рис.3 результаты верификации положительных на наличие гена SpvC проб рестрикцией Taq1.

Таблица 4. Результаты исследования наличия Spv региона у сальмонелл изолированных на с./х. предприятиях Сибири и Алтая.

наименование	Источник выделения	Кол-во культур имеющих SPV оперон	Количество тестированных культур
Sl. typhymurium	Продукты животноводства	2	2
Sl. choleraesuis	Печень птицы	1	1
Sl. enteritidis	Печень птицы	1	2
Sl. hamburg	ЖКТ птицы	2	2
Sl. enterica	Органы яйцепродукции птиц	3	6
Sl. dublin	Теленок, печень	1	1
Всего культур протестировано	14	42

Как следует из таблицы 4, около 33% культур имеют Spv оперон, что делает их опасными как в эпидемическом так и эпизоотическом отношении. Полученные результаты в целом совпадают с данными зарубежных исследователей [5,6].

Таким образом, система детекции и верификации высокопатогенных форм сальмонелл имеющих Spv оперон должна включать в себя спектр микробиологических техник обеспечивающих достаточную чувствительность и селективность, системы идентификации вида дублирующие друг друга но основанные на разных методических подходах и молекулярных механизмах. С целью повышения достоверности результатов ПЦР, исключения ложноположительных реакций не обусловленных кросс-контаминацией целесообразно ставить ПЦР только с плазмидной ДНК, а полученные положительные пробы дополнительно перепроверять рестрикцией.

3.3 Гены Rck и PagC

Salmonella могут проникать в нефагоцитирующие клетки благодаря наличию системы секреции III типа (T3SS-1), которая запускает триггер интернализации в клетку. Существуют данные что проникновение бактерий Salmonella enterica серовара Enteritidis в эукариотические клетки может также обеспечиваться внешним мембранным белком Rck

Rck – зависимая интернализация сальмонелл происходит путем активации комплекса Arp2/3 при участии малых GTPаз Rac1 и Cdc42. В результате формируется зиппер-подобное выпячивание мембраны эукариотической клетки обеспечивающее попадание сальмонелл внутрь клетки. Таким образом сальмонеллы являются единственными известными бактериями способными попадать внутрь клеток как через триггер-механизм, так и через зиппер-механизм интернализации [34].

Хотя у вирулентных штаммов сальмонелл наружние мембранные белки Rck and PagC имеют достаточно высокую гомологию по аминокислотным последовательностям (53%) сходство их функций не очевидно. Rck ассоциируется с устойчивостью к комплементу, адгезией на эпителии и инвазией [35, 36], тогда как PagC обеспечивает выживаемость при фагоцитозе и развитие системной инфекции [37]. Эти частичное расхождение функций лежит в основе участка с наибольшим сходством нуклеотидной последовательности локализованного в трансмембранной части токсинов, тогда как наибольший уровень различий нуклеотидных последовательностей наблюдается во внеклеточных доменах протеинов в основном определяющих межклеточные взаимодействия [38]. Тем не менее число сходных аминокислотных остатков больше между Rck и PagC чем между Rck , PagC и их ортологом Yersinia Ail, который подобно Rck обеспечивает адгезию и инвазию [39, 40]

3.4 Тестирование на наличие генов устойчивости к аминогликозидам StrA и StrB

StrA и StrB гены кодируют стрептомицин фосфотрансферразы Aph3 и Aph6 обеспечивающие устойчивость к стрептомицину но неактивные в отношении спектиномицина. Обычно эти гены локализуются внутри транспозона Tn5393 [41] и в «родительской» последовательности Tn5393c. [42, 43] свободной от IS элементов.

Sul2 ген кодирует сульфаниламид устойчивую дигидроптероат синтазу. Как отмечено ранее [42], RSF1010 и pSRC15 содержат протяженный 1778п. н. сегмент транспозона Tn5393 который включает в свовем составе strAB и прилегающий к ним инвертированный повтор (IRR). Sul2 изначально не входили в состав этого генетического элемента, как следует из исследований некоторых авторов (GenBank последовательность. AB277723) Sul2 обнаружен в составе малого мобильного элемента CR2 [44]

3.5 Нитроцефиновый тест

 -латамазы, группа ферментов разрушающих антибиотики лактамного ряда. Многие из этих ферментов кодируются в мобильных детерминантах патогенности (плазмидах и транспозонах) и могут передаваться горизонтально между бактериями одного вида, возможен также межвидовой перенос. Однако эффективность выявления устойчивости, связанной с продукцией БЛРС, с помощью традиционных методов оценки чувствительности остается крайне низкой. Все  - лактамазы делятся на 4 типа A, B, C, D из них B тип является металлобетталактамазами и характеризуется широким спектром действия фермента. -лактамазы различаются также по спектру активности, наиболее опасными являются  лактамазы расширенного спектра действия. Продукция -лактамаз расширенного спектра (БЛРС) – один из наиболее распространенных и клинически значимых механизмов резистентности энтеробактерий к современным -лактамным антибиотикам [45].

Одним из способов выявления бетталактамаз является нитроцефиновый тест, сущность теста заключается в выявлении бетта-лактамаз которые разрушают хромогенный субстрат – цефалоспориновый антибиотик цефиназу с образованием хромогенного субстрата. Для выявления нитроцефиновой (цефиназной) активности культур, следует ресуспендировать свежую культуру в капле физиологического раствора (1-2 бактериальных петли при отборе материала с твердой питательной среды или 1-2 капли бульонной культуры), и пропитать диск с нитроцефином. Нередко бетта-лактамазная активность выявляется сразу в течение 5-10 минут, в виде розового окрашивания, однако рекомендуется инкубировать диски при 37 С в течение 1 часа, желательно во влажной камере (например, чашке Петри). Особенность применения антибиотиков лактамного ряда, при терапии инфекций желудочно-кишечного тракта, равно как и при пероральном применении лактамных антибиотиков заключается в том, что защиту патогенного микроорганизма от антибиотика может обеспечить любой компонент микробиоценоза секретирующий фермент бетта-лактамазу. В связи с этим, мы рекомендуем тестировать нативное кишечное содержимое на наличие бетта-лактамазной активности.

Предложенная нами модификация метода заключается в следующем: свежий образец кишечного содержимого или фекалий (помета) отбирают ложкой Фолькмана или Люэра (предварительно обожженной на огне спиртовки). Образец ресуспендируют в 1 мл стерильного физиологического раствора, сначала путем смывания кишечного содержимого с ложки Фолькмана, потом с помощью пипетки. 50 мкл. суспензии наносят на предметное стекло в виде капли, аналогичным образом поступают с остальными пробами кишечного содержимого (ложку Фолькмана следует каждый раз очищать от остатков предыдущей пробы и обжигать над пламенем спиртовки). Затем на капли суспензий раскладывают диски с нитроцефином, предметное стекло помещают в чашку Петри и инкубируют не менее часа, после чего проводят учет результатов как описано выше (см. также рис.4). Метод удобен для обоснования назначения антибиотиков лактамного ряда а также мониторинга адаптации кишечных микробиоценозов к антибиотику.

Рисунок 4. Результаты тестирования проб помета на бетта-лактамазную активность (первые 4 пробы положительны, проба 5 - отрицательна).

4. Флюориметрические методы исследований сальмонелл для исследования фагоцитоза

Изучение фагоцитоза осуществляют с использованием свежей крови кролика и флюоресцентномеченных бактерий. Бактерии к заражению подготавливаются двумя различными способами:

1) В культуру клеток добавляют реакционно-способную группу (сукцинимидное производное флюоресцеина). Флюоресцентная метка связывается в щелочной среде рН 8 с лизином (положительно заряженная аминокислота) на поверхности прокариотической клетки.

2) К бактериям добавляют краситель флюоресцеина диацетат (ФДА) - его особенность — эффективный транспорт в живую бактериальную клетку. После его транспорта внутрь бактериальной клетки, эстераза отщепляет СН3 группу у ФДА и образуется флюоресцин флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах. Получается светящаяся изнутри бактерия.

Микроскопию проводят, например, с использованием эпифлюоресцентного микроскопа ImagerD1 (CarlZeiss) и программного обеспечения AxioVision. Также использовали конфокальный микроскоп фирмы Olympus.

Принцип метода состоит в том, что при фагоцитозе бактериальной клетки окрашенной снаружи, флюоресцеин может снижать свою флюоресценцию при закислении рН внутри фаголизосомы, а при использовании флюоресцеина находящегося внутри бактериальной клетки снижение светимости будет происходить только внутри погибших клеток.

Использование меченых бактерий позволит зафиксировать:

- образование фагосом

- этап слияния фагосомы с лизосомой — по снижению светимости клеток меченных сукцинимидным производным флюоресцеина снаружи и сохранению светимости живых бактериальных клеток меченных FDA.

Также в работе использовался краситель — трипановый синий, который гасит флюоресцентное свечение (квенчинг) у бактерий, которые не подверглись фагоцитозу.

Пробоподготовка окрашивания бактерий ФДА

1. Готовим предварительно рабочий раствор ФДА (из маточного раствора ФДА 1 мг/мл):

1мкл ФДА + 1мл Физиологического р-ра

В 4 пробирки вносим по 1 мл физ. раствора. Потом в них же в первую пробирку добавляем 1 мкл ФДА, во вторую 2 мкл ФДА, в третью – 3мкл, и в четвертую - 4 мкл соотвественно.

2. Готовим рабочую суспензию бактерий:

Использовали культуру клеток S.enterica Jl/bnc 13 = назовем ее A. В физ. растворе или PBS следует отмыть клетки от питательной среды. Для этого А — центрофугировали 3000 оборотов 2 минуты (далее 3000\2). Слили супернатант. Затем добавили 500 мкл PBS(рН=7,2 - 7,4) и центрифугировали 3000\2. Слили супернатант и опять добавили 500 мкл PBS, центрифугировали 3000\2, слили супернатант. Потом добавили 200 мкл PBS и разлили бактерии по четырем пипеткам по 50 мкл в каждую

3. Метим бактерии ФДА: для этого в суспензию бактерий капаем ФДА.

4. Инкубируем 30 минут.

5. Затем центрифугируя отмываем бактерии от непоглощенного флуоресцина (3-4 раза):

- центрифугируем 3000\2, сливаем надосодок

- +1000мкл физ р-ра и центрифугируем 3000\2, сливаем надосадок

- +1000мкл физ р-ра и центрифугируем 3000\2, сливаем надосадок

- +200мкл физ р-ра и смотрим на эпифлюоресцентном микроскопе через 10 минут, 20 минут, 1 час, 2 часа.

Пробоподготовки окрашивания бактерий сукцинимидным производным

Приготовление маточного раствора 2мг\мл = 2 мг сукцинимида + 1мл(1000 мкл) ацетона (необходим неполярный растворитель)

Сукц2 = Приготовление 0,2 мг/мл раствора = 450 мкл физ р-ра или дист Н2О + 50 мкл маточ. раствора (– хранится недолго из-за гидролиза).

Берем 6 пробирок и в каждую вносим 1,5 мл суспензии бактерий. Центрифугируем 5000/8, сливаем надосадок, добавляем в каждую пробирку 0,1М КБК 200 мкл (рН=8, готовим – 1 таблетка на 100 мл, по уже заданной концентрации), т. е. в каждой пробирке получаем 200 мкл смеси бактерий с КБК. Далее в первую пробирку добавляем 200 мкл сукцинимидной смеси, перемешиваем (плч 0,1 мг/мл). Потом берем 200 мкл из этой пробирки и вносим во вторую пробирку, перемешиваем(0,05 мг/мл). И т. д. со всеми пробирками. Потом все пробирки ставим на ночь в холодильник. Утром 2х кратное промывания в PBSе.