Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов (стр. 1 )

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Будкера

Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Новосибирск - 2011 г.

УДК: 636.619

Молекулярно-биологические методы контроля сальмонеллезов/ Россельхозакадемия. ГНУ ИЭВСиДВ, РАН. Сибирское отделение ИХБФМ, ИЯФ, НГУ - Новосибирск, 20с.

Современные методы выявления, идентификации сальмонелл, мониторинга сальмонеллезной инфекции позволяют существенно изменить эпизоотическую и эпидемическую ситуацию.

В данных методических рекомендациях дан обзор современных методов исследования сальмонелл и контроля эпизоотического процесса при сальмонеллезах

Данные рекомендации рассчитаны на сотрудников НИУ и специалистов по лабораторной диагностике.

Методические рекомендации подготовили: канд. биол. наук , , канд. вет. наук , к. в.н. (ГНУ ИЭВСиДВ), канд. биол. наук , , (ИХБФМ СО РАН) А. Дудников ИЯФ (СО РАН), , НГУ, канд. вет. наук (НГАУ)

Рекомендации рассмотрены и утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (протокол № от 2011 г. ) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № от 2011 г.).

Работа выполнена в рамках интеграционного проекта СО РАН №16

Рецензент: д-р вет. наук

Содержание:

	Стр.
Введение	4
1. Таксономия сальмонелл	5
2.Определение антигенной структуры	5
2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов.	6
2.2Антигенспецифичная ПЦР	7
3 Определение факторов патогенности и антибиотикорезистентности	8
3.1 Структурная организация факторов патогенности в геноме сальмонелл	8
3.2 Выявление гена SpvC	9
3.3 Гены Rck и PagC	14
3.4 Тестирование на наличие генов устойчивости к аминогликозидам StrA и StrB	15
3.5 Нитроцефиновый тест	16
4.Флюориметрические методы исследований сальмонелл для исследования фагоцитоза	18
5. Определение антибиотикорезистентности в микропланшетном формате	21
6. Молекулярная эпизоотология	26
6.1 VNTR типрирование	26
6.2 Дискриминация штаммов и изолятов с использованием метода PFGE	27
6.3 ПЦР мониторинг для контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий	29
7.Методические подходы, для контроля сальмонеллезов, на птицефабрике	35
8. Бактериологические методы изоляции возбудителя	38
9. Серологический мониторинг сальмонеллоносительства	41
10. Методические подходы к снижению реинфекции и рецидивирования сальмонеллоносительства	43
11. Эпизоотологические методы борьбы с антибиотикорезистентностью	44
12.Повышение эффективности антибиотикотерапии	45
13. Постантибиотические дисбактериозы как фактор реинфицирования.	46
14.Изучение радиорезистентности сальмонелл	47
15. Фаготипирование изолятов сальмонелл	52
Заключение
Литература

Введение: Вид Salmonella enterica включает в себя более 2500 сероваров, характеризующихся различной устойчивостью к антибиотикам, гостальной специфичностью, токсичностью, патогенностью, вирулентностью, природными резервуарами и т. д. В то же время идентификация серовара только иммунохимическими методами не представляется достаточно адекватной, т. к. патогенность внутри отдельного серовара сальмонелл может варьировать благодаря наличию плазмид, мутаций и рекомбинации в хромосомной ДНК. Изменение антигенной структуры сальмонелл может происходить за счет незначительных генетических изменений в относительно небольшом числе генов, и, соответственно, иммунохимические методы типирования не в полной мере отражают генетическую изменчивость того или иного изолята сальмонелл.

Целью исследования было усовершенствовать систему изоляции и типирования сальмонелл при мониторинге сальмонеллоноситества для свинокомплексов и птицефабрик.

1. Таксономия сальмонелл

Все серовары сальмонелл относятся к двум видам: S. bongori и S. enterica. Последний разделяется на 5 подвидов, обозначаемых собственными именами и цифрами: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV) и indica (V). Для человека патогенны первые два подвида, причем подвид enterica (I) включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров микроба (1400 из 2500). В этиологии внекишечного сальмонеллеза основную роль играют S. typhimurium (34%) и S. enteritidis (21%). Далее следуют следующие серовары: S. panama (6%). S. choleraesuis (5%) и S.virchow (5%). На долю остальных приходится 29% [1, 2]. Смертность при внекишечных формах сальмонеллеза у человека варьирует от 7% для инфекций костно-суставной системы до 60-80% для инфекций дыхательной системы и ЦНС [3].

2. Определение антигенной структуры

2.1 Молекулярные механизмы образования О антигенов.

Сальмонеллы серогрупп А, B, D характеризуются иммунодоминантными антигенами имеющими в своем составе паратозу, абеквозу и тивелозу. Наличие гена rfbJ абеквоза синтаза, обеспечивает синтез О антигена на основа GDP-абеквозы а ген rfbS паратоза-синтаза необходим для синтеза О антигенов групп B и D дальнейшая конверсия GDP паратозы с использованием продукта гена rfbE GDP-тивелоза-эпимераза конвертирующая паратозу в тивелозу необходимую для синтеза О антигена группы D (рисунок 1).

Рис1. Финальные этапы путей синтеза углеводных единиц полисахаридных О-антигенов сальмонелл различных серогрупп абеквозы, паратозы и тивелозы.

Рис. 2 (A) Структуры О - антигенов S. enterica групп B, D1, D1 соответствующих фаготипам P27, D2, D3, and E1. Абревиатуры: Abe, абеквоза; Gal, галактоза; Man, манноза; Rha, рамноза; Tyv, тивелоза. .

(B) Представлен эпитоп O антигена S. enterica серовара Zuerich группы D3.Утолщенная линия окружающая олигосахаридную единицу символизирует значимость углевода в структуре эпитопа, тонкая линия отмечает важные сахара в комбинации, прерывистая линия отмечает дополнительные углеводы, которые могут легко утрачиваться в процессе экспрессии эпитопов (modified after Nghiem et al. [28]).

О – единицы S. enteric группы D2 (O9,46) отличаются от группы D1 (O9,12) мономерными комбинациями остатков маннозы(reviewed by Kauffmann), галактозил-маннозная связь при полимеризации О антигена у сальмонелл группы D1 формируется в положениях 1 – 2, а у группы D2 [7.] в положении 1-6 О - единица S. enterica E1 (O3,10) имеет такую же олигосахаридную единицу как у группы D2, но без тивелозы [9].

Гены обеспечивающие синтез О антигенов локализуются совместно в хромосоме в составе генного кластера rfb[4]. Гены кодирующие синтез сахаров и трансферразы необходимы для синтеза повторяющихся олигосахарилдных единиц О антигена. Ген именуемый wzx (ранее rfbX) кодирует протеин входящий в состав 12 потенциальных трансмембранных сегментов, найден во всех кластерах генов О-антигена сальмонелл. Wzx – протеины из различных О антигенных кластеров обладают структурной гомологией но имеют незначительное сходство по аминокислотному составу [6]. Предполагается, что Wxz обеспечивает перенос из цитоплазмы на периплазматическую зону цитоплазматической мембраны.

Жгутиковые антигены H1 и H2 (фаза 1 и 2) кодируются генами fliC и fljB соответственно. Как правило, эти гены локализуются на разных участках хромосомы, но только один из генов экспрессируется клетками благодаря механизму регуляции оперона fljBA[5].

2.2 Антигенспецифичная ПЦР

Подробный анализ структуры антигенов сальмонелл и генов ответственных за синтез антигенов, сделал возможныпм создание ПЦР тестов для определения серотипов сальмонелл. В таблице 1 приведены структуры праймеров и примеры тестов для определения серотипа сальмонелл метобом ПЦР [10].

Таблица 1. Структруы праймеров и размеры ампликонов для определение серотипов сальмонелл методом ПЦР.

Ген	Нуклеотидная последовательность	Ампликон п.н.
O-antigen multiplex
abe1 (B)	F: GGCTTCCGGCTTTATTGG	561
	R: TCTCTTATCTGTTCGCCTGTTG
wbaD-manC (C1)	F: ATTTGCCCAGTTCGGTTTG	341
	R: CCATAACCGACTTCCATTTCC
abe2 (C2)	F: CGTCCTATAACCGAGCCAAC	397
	R: CTGCTTTATCCCTCTCACCG
prt (A/D1)	F: ATGGGAGCGTTTGGGTTC	624
	R: CGCCTCTCCACTACCAACTTC
wzx – wzy (E1)	F: GATAGCAACGTTCGGAAATTC	281
	R: CCCAATAGCAATAAACCAAGC
H1-1 multiplex
fliC (i)	F: AACGAAATCAACAACAACCTGC	508
	R: TAGCCATCTTTACCAGTTCCC
fliC (g, m)	F: GCAGCAGCACCGGATAAAG	309
	R: CATTAACATCCGTCGCGCTAG
H1-2 multiplex
fliC (r)	F: CCTGCTATTACTGGTGATC	169
	R: GTTGAAGGGAAGCCAGCAG
fliC (z10)	F: GCACTGGCGTTACTCAATCTC	363
	R: GCATCAGCAATACCACTCGC
H2 multiplex
fljB (I: 1,2; 1,5; 1,6; 1,7)	F: AGAAAGCGTATGATGTGAAA	294
	R: ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC
fljB (II: e, n,x; e, n,z15)	F: TAACTGGCGATACATTGACTG	152
	R: TAGCACCGAATGATACAGCC

3. Определение факторов патогенности и антибиотикорезистентности

3.1 структурная организация факторов патогенности в геноме сальмонелл

Одним из факторов патогенности преимущественно нетифоидных сальмонелл является Spv оперон содержащий гены патогенности SpvA, SpvB, SpvC и регуляторный ген SpvR [11, 12]. Продукты экспрессии генов патогенности Spv оперона обеспечивают устойчивость сальмонелл к фагоцитозу путем рибозилирования элемента цитоскелета актина предотвращая тем самым слияние фагосомы с лизосомой у макрофагов [13, 14]. В связи с этим штаммы сальмонелл имеющие Spv оперон с гораздо большей частотой вызывают септические процессы у человека и животных [16, 17], у сельскохозяйственной птицы такие штаммы чаще изолируются из внутренних органов (печень, сердце, органы яйцепродукции).

Spv оперон кодируется в различных плазмидах размерами от 60 тыс п. н. до 120 тыс. п. н. хотя большинство этих плазмид серотипоспецифично, однако показана возможность их репродукции у сальмонелл других серотипов.

Частота встречаемости плазмид у сальмонелл разных сероваров варьирует, например Typhi, Paratyphi, Hadar, Infantis и большинство экзотических сероваров не содержат плазмид, а среди сероваров Enteritidis, Typhimurium, Dublin, Choleraesuis, Gallinarum, Pullorum and Abortusovis напротив, редко встречаются изоляты не содержащие плазмид.

У сальмонелл плазмиды подразделяют с функциональной точки зрения на две группы. В первую группу входят функционально значимые плазмиды это серовароспецифические, ассоциируемые с патогенностью и антибиотикорезистентностю плазмиды размерами от 40000 до 160000 п. н. и плазмиды меньших размеров, функциональное значение которых в реализации патогенного потенциала сальмонелл не доказана [18].

Таблица 2 Факторы вирулентности кодируемые серовар-специфичными плазмидами

ген	S. typhimurium	S. enterrtidis	S. choleraesuis	S. gallinarum	S. dublin
spv rck pef srg A mig-5	+ + + - +	+ + + + +	+ - + + +	+ - - - +	+ - - ? +

Ген rck найденный у S. Typhimurium и S. Enteritidis ассоциируется с повышенной устойчивостью сальмонелл к комплементу [19]. Продукт гена rck представляет собой поверхностный мембранный протеин блокирующий полимеризацию компонента комплемента С9 и предотвращающий тем самым повреждение мембраны бактериальной клетки (Плазмиды вирулентности Typhimurium, Enteritidis and Choleraesuis кодируют pef фимбрии [20]. Как было показано на лабораторных мышах, фимбрии способны обеспечивать адгезию сальмонелл на кишечном эпителии и индуцировать продукцию жидкости [21]. У сероваров Gallinarum and Dublin, pef локус отсутствует, однако плазмиды вирулентности кодируют фимбрии имеющие частичное сходство с фимбриями K88 E. coli. [22]. Mig-5 экспрессируется при фагоцитозе сальмонелл макрофагами однако биологический смысл протекающих при этом биохимических реакций остается неясным [23].