Механизмы антиандрогенной активности комбинированного препарата дроспиренон/этинилэстрадиол (стр. 6 )

В качестве стимуляторов активации лимфоидных клеток в нашей работе были использованы различные по своим свойствам соединения: экзомитогены - конканавалин А, декстрансульфат и арахидоновая кислота, которая по своей природе является эндомитогеном. Добавление к лимфоцитам 0.1 мг/мл декстрансульфата (Dex S) - митогена В-лимфоцитов или 25 мкг/мл конканавалина А (Con А) - митогена, действующего в основном на Т-звено иммунитета, вызывало увеличение внутриклеточной концентрации кальция до 189±12 нМ (n=6) и 220±18 нМ (n=6) соответственно. Более выраженный ответ на Т-митоген определяется, вероятно, преимущественным содержанием Т-лимфоцитов в суспензии клеток.

Действие митогенов на лимфоидные клетки, как известно, опосредовано высвобождением из фосфолипидов арахидоновой кислоты и ее выходом в инкубационную среду. Арахидоновая кислота и ее метаболиты участвуют в регуляции разнообразных физиологических процессов, в том числе активации и делении лимфоцитов. Освобождение АА из фосфолипидных компонентов плазматической мембраны происходит под влиянием фермента фосфолипазы А2 или последовательного действия фосфолипазы С и диацилглицеринлипазы. В лимфоидных клетках, по-видимому, преобладает второй путь [Fukuda S. et al., 2004].

При изучении влияния арахидоновой кислоты (АА) в концентрации 3 мкМ на изменения внутриклеточной концентрации Са2+ в лимфоцитах наблюдали быстрое достоверное увеличение [Са2+]цит до 240 ± 25 нМ (р <0,05). Для того, чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии АА, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции (рис. 1,б). АА (3 мкМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 ± 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-ответа на АА в среде без Са позволяют предположить, что арахидоновая кислота индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Ca2+ на фоне действия АА к суспензии клеток добавляли ЭГТА (1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Ca2+]цит (рис. 2,а), который восстанавливался при добавлении CaCl2 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на лимфоциты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Ca2+ из внутриклеточных депо.

Рис. 1. Влияние ЭГТА на индуцированное арахидоновой кислотой (АА) повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ CaCl2 (а) и в бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - АА (3 мкМ), 2 – ЭГТА (1 мM), 3 - CaCl2 (4.5 mM).

АА (3 мкМ) на фоне ЭГТА вызывала увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция примерно на 55 ± 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-ответа на АА в среде без Са позволяют предположить, что арахидоновая кислота индуцирует выход ионов кальция из внутриклеточных депо клеток. Если в среде с ионами Ca2+ на фоне действия АА к суспензии клеток добавляли ЭГТА (1 мМ), наблюдалось резкое снижение уровня [Ca2+]цит (рис.1,а), который восстанавливался при добавлении CaCl2 за счет поступления ионов кальция через каналы плазматических мембран. Таким образом, при действии АА на лимфоциты Са-ответ является суперпозицией двух процессов: транспорта ионов Са из инкубационной среды в цитоплазму, а также выхода Ca2+ из внутриклеточных депо. Добавление АА (3 мкМ) на фоне действия дроспиренона (3 мкМ) приводило к росту [Ca2+]цит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что напоминает увеличение Ca2+ в бескальциевой среде (рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций дроспиренон блокирует Са-каналы плазматических мембран и препятствует индуцированному арахидоновой кислотой входу Ca2+ извне в клетки. В то же время гестаген практически не влияет на стимулированный АА выход Ca2+ из внутриклеточных депо.

Исследование аденилатциклазного звена клеточного ответа лимфоцитов показало, что базальный уровень цАМФ составил в среднем 2.3 ± 0,6 пмоль/107 клеток (n=10). При определении влияния Con А на содержание цАМФ в лимфоцитах были обнаружены значительные индивидуальные различия. Добавление к суспензии лимфоцитов Con А (25 мкг/мл) в одних случаях (7 наблюдений) приводило к достоверному снижению уровня цАМФ (1.2 ± 0,4 пмоль/107 клеток), в других (6 наблюдений) вызывало увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ (3.1 ± 0,4 пмоль/107 клеток). АА в изученном диапазоне концентраций (1-3 мкМ) достоверно не изменяла внутриклеточное содержание цАМФ. Исследование влияния дроспиренона (3мкМ) на цАМФ-ответ клеток не позволило выявить какие-либо закономерности.

Полученные нами данные свидетельствуют, что дроспиренон в концентрации 3 мкМ подавлял подавляет митогениндуцированное увеличение [Са2+]цит и не влиял влияет на базальный уровень кальция в лимфоцитах периферической крови человека. Для проявления Са-блокирующего эффекта дроспиренона латентный период не требовался. В изученной дозе дроспиренон не влиял на митоген-индуцированные изменения уровня цАМФ. Таким образом, ингибирующее действие гетагена на лимфоциты периферической крови человека опосредовано угнетением Са-ответа клеток. Механизмы регуляции активности лимфоцитов, включающие аденилатциклазную систему, по-видимому, не являются точкой приложения негеномного действия гестагена дроспиренона.

Рис. 2. Влияние ЭГТА на индуцированное арахидоновой кислотой (АА) повышение уровня [Са2+]цит в среде, содержащей 1 мМ CaCl2 (а) и в бескальциевом буфере (б). Обозначения: 1 - АА (3 мкМ), 2 – ЭГТА (1 мM), 3 - CaCl2 (4.5 mM).

Рис. 3. Влияние арахидоновой кислоты на уровень ионов кальция в лимфоцитах на фоне действия дроспиренона. Условия и обозначения как на рис. 1. Обозначения: АА - арахидоновая кислота (3 мкМ), ГК - дроспиренон (3 мкМ).

Негеномный эффект андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах.

На следующем этапае работы мы сравнили характер Целью данной работы явилось определение мембранотропного действия андрогенов (тестостерона, дигидротестостерона), соединений с выявленной антиандрогенной активностью (ципротерона ацетата, дроспиренона) и АБМП на внутриклеточную концентрацию свободных ионов кальция в цитоплазме лимфоцитов ([Са2+]цит) периферической крови человека. 17a-ацетокси-3b-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-он (АБМП) - новое отечественное соединение с гестагенной активностью, обладающее рядом преимуществ по сравнению с другими гестагенами. В ряде работ была показана его гестагенная активность и перспективность применения в качестве противоопухолевого препарата и средства повышающего противоопухолевое действие цитостатиков [ и соавт., 2006]. Однако, в то же время антиандрогенные свойства АБМП остаются малоизученными.