Механизмы антиандрогенной активности комбинированного препарата дроспиренон/этинилэстрадиол (стр. 7 )

Базальный внутриклеточный уровень ионов кальция в цитоплазме лимфоцитов не превышал значения 110 нМ (98±12 нМ). Внесение в суспензию клеток 1 мкМ тестостерона (Т) вызывало увеличение внутриклеточной концентрации кальция: эффект развивался быстро – в течение нескольких секунд, максимум [Са2+]цит отмечался через 1,5-2 мин и достигал значения 209±12 нМ (n=6). В течение последующего времени наблюдения [Са2+]цит снижался с выходом на стационарный уровень, составлявший 135±11 нМ. Для того чтобы определить, откуда ионы кальция поступают в цитоплазму клеток при действии Т, были проведены эксперименты в бескальциевой среде. Ca2+ в инкубационной среде связывали ЭГТА (конечная концентрация 1 мкМ), что приводило к резкому снижению базального уровня флуоресценции. Т (1 мкМ) на фоне ЭГТА вызывал увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция на 55 ± 12 нМ (р<0,05), что примерно в два раза меньше реакции, наблюдаемой в инкубационной среде с нормальным содержанием ионов кальция. Данный факт, а также характерная кинетика Са-ответа на Т в среде без Ca2+ позволяют заключить, что тестостерон индуцирует вход ионов кальция из внеклеточной среды через Са-каналы цитоплазматической мембраны. Для проверки гипотезы о мембранотропном характере действия Т в нашей работе был использован коммерческий препарат тестостерона, ковалентно иммобилизованный на БСА (бычий сывороточный альбумин, «Sigma»). Высокомолекулярный препарат тестостерона не способен проникать через цитоплазматическую мембрану клеток, ему не доступны внутриклеточные места связывания андрогенов. Динамика и выраженность влияния Т-БСА на [Са2+]цит повторяли выявленные нами закономерности действия свободного Т, что свидетельствует в пользу мембранотропного действия Т (рис. 2). Важно отметить, что активный метаболит Т – дигидротестестерон, сродство к внутриклеточным рецепторам андрогенов которого существенно выше, чем у Т, по способности увеличивать [Са2+]цит уступал Т примерно в 2 раза (рис. 24).

Рис. 2. Влияние андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах.

Обозначения: 1 – базальный уровень; 2 - тестостерон (1 мкМ); 3 – дигидротестостерон (1 мкМ); 4 – тестостерон-БСА (1 мкМ в расчете на соедержание тестостерона). Условия: время инкубации с препаратами 1 мин.

Таким образом, помимо классического рецептор-опосредованного геномного пути андрогены оказывают прямые эффекты на клетки-мишени, осуществляемые системой вторичных мессенджеров и изменением ионной проницаемости мембран для ионов кальция. По своим признакам влияние Т на [Са2+]цит может быть отнесено к специфическим мембранотропным эффектам стероидов. Общими для них признаками являются: быстрое развитие, как правило, в пределах 10 мин; проявляются в диапазоне 0,1-5 мкМ; обратимы; отменяются антагонистами стероидов мембранного типа действия и не чувствительны к антагонистам внутриклеточных рецепторов стероидов, блокаторам синтеза РНК и белка [Calder PC, et al., 2002; Simoncini T., Genazzani AR., 2003]. Отличительным свойством влияния Т на [Са2+]цит является его негеномный характер, тогда как геномные мембранотропные эффекты опосредованы взаимодействием андрогенов с внутриклеточными рецепторами и последующим изменением транскрипции отдельных генов [Heinlein CA., Chang C., 2002].

Для оценки антиандрогенного эффекта изучаемых соединений мы определяли Т-индуцированные изменения [Са2+]цит в присутствии различных концентраций ципротерона ацетата, дроспиренона или АБМП, вычисленные значения IC50 приведены в табл. 9. Наименее активным препаратом был ципротерона ацетат, его ингибирующее действие в максимальной концентрации 10 мкМ на стимулированный подъем кальция составляло не более 20% от контрольных значений (в отсутствие в среде инкубации ципротерона ацетата). Наиболее выраженным эффектом отличался гестаген дроспиренон. Добавление Т (1 мкМ) на фоне действия дроспиренона (3 мкМ) приводило к росту [Са2+]цит на 52 ± 13 нМ (р<0,02) от базального уровня, что соответствует значениям стимулированного уровня Ca2+ в бескальциевой среде. Эффект дроспиренона характеризуется наличием дозовой зависимости в изученном диапазоне концентраций (0,1-10 мкМ). Новый отечественный гестаген АБМП характеризовался умеренным антиандрогенным действием на стимулированное тестостероном увеличение [Са2+]цит. Вычисленное среднее значение IC50 для АБМП составляло 8,4 мкМ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в терапевтической области концентраций дроспиренон и, в меньшей степени, АБМП подавляют негеномноеый действиеэффект андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах человека.

При рассмотрении возможных механизмов антиандрогенного действия гестагенов дроспиренона и АБМП необходимо учитывать наличие их негеномного мембранотропного действия на обмен вторичных мессенджеров в клетках-мишенях андрогенов. Лимфоциты человека могут быть использованы в качестве экспериментальной тест-системы для скрининга и изучения молекулярных механизмов действия новых соединений, обладающих антиандрогенной активностью.

Рис. 4. Влияние андрогенов на содержание ионов кальция в лимфоцитах.

Обозначения: 1 – базальный уровень; 2 - тестостерон (1 мкМ); 3 – дигидротестостерон (1 мкМ); 4 – тестостерон-БСА (1 мкМ в расчете на соедержание тестостерона). Условия: время инкубации с препаратами 1 мин.

Таблица 9. Влияние изученных соединений на тестостерон-индуцированное увеличение уровня кальция в лимфоцитах (ингибиторный анализ)

Примечание: IC50 – значение концентрации препарата, при котором наблюдается снижение Са2+-стимулирующего действия тестостерона на 50%.

Заключение

Таким образом, проведение данной клинико-эксперимнентальной работы позволило установить выраженнойую антианднрогеннойую активностиь препарата дроспиренон/этинилэстрадиол у женщин с угревой болезнью. При изучении биохимических механизмов реализации антиандрогенного действия данной комбинации была выявлена важная роль гестагенного компонента – дроспиренона, который по конкурентному механизму ингибирует специфическое связывание андрогенов с их цитозольными рецепторами, регулирующими активность генов, определяющих андрогенный фенотип. Если эта активность дроспиренона была немного слабее известного антиандрогена ципротерона ацетата, то негеномные эффекты дроспиренона, выражающиеся в уменьшении мембранотропных эффектов тестостерона были сильнее в случае дроспиренона. Способность дроспиренона блокироватиь способность тестостерона увеличивать кальциевую проницаемость в клетках мишенях может иметь дополнительное терапевтическое преимущество, выражающееся в снижении артериального давления, которое наблюдается у женщин при приеме ими комбминации дроспиренон/этинилэстрадиол. В связи с этим есть все основания считать, что комбинация дроспиренон/этинилэстрадиол обладает полезными геномными и негеномными андтиандрогенными эффектами у женщин старадающих гипернандрогенией и одновременно нуждающихся в контарацепции. Такая рекомендация имеет теоретические обоснования, выражающиеся в быстрых мембраннотропных и отсроченных геномных эффектах дроспиренона, направленных на снижение избыточной активности андрогенов у некоторых женщин.