АНАЛИЗ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА ALLIUM URSINUM L. С ПОМОЩЬЮ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И ISSR-МАКЕРОВ
*, ,
Белорусский государственный университет, пр. Независимости, 4, Биологический факультет, 220030, г. Минск, Беларусь,
******@***ru
Охраняемые растения, Allium ursinum, морфологический полиморфизм, молекулярно-генетический полиморфизм, ISSR-маркеры, уникальные и видоспецифичные локусы
Введение. Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности. Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Изучение генетического разнообразия селекционного материала, образцов коллекций генбанков и диких видов растений проводится с помощью молекулярно-генетических маркеров, и позволяет получить так называемые генетические фингерпринты – набор маркеров определенного размера, уникальный для изучаемого образца. Генетическая паспортизация линий и сортов сельскохозяйственных культур с помощью ДНК-маркеров принята в ряде стран, в том числе и в Республике Беларусь. Проведение аналогичных исследований генофонда редких и исчезающих видов не менее важно, поскольку позволит как оценить внутривидовой полиморфизм, так и создать типичные «генетические паспорта» для охраняемых видов растений с целью поддержания и сохранения биоразнообразия.
Многие виды охраняемых на территории Беларуси растений являются сложными комплексами внутри - и надвидовых таксонов. Изучение этих видов на молекулярно-генетическом уровне позволит решить главную проблему в поддержании биоразнообразия - отбор наиболее типичных представителей популяций и создание генетически обоснованных программ по их сохранению, а также стать решающим аргументом для таксономической дифференциации объектов исследования.
Черемша (Allium ursinum L.), иногда также называемая медвежьим, или диким луком, - многолетнее травянистое луковичное растение, принадлежащее к роду Allium семейства Луковые (Alliaceae). Вид распространён в Европе, в том числе на Украине, в Беларуси, на Кавказе. Черемша занесена в Красные книги Смоленской области России, а также Беларуси, Латвии, Литвы, Украины. На территории Беларуси этот реликтовый, по происхождению среднеевропейский вид находится на северо-восточной границе равнинной части ареала и охраняется с 1964 года, принадлежит к 3 категории охраны [1].
На территории Европы данный вид представлен двумя подвидами: Allium ursinum subsp. ursinum и Allium ursinum subsp. ucrainicum [2]. В Беларуси внутривидовая дифференциация черемши не изучалась, хотя по территории республики должна проходить граница распространения этих двух подвидов. Так, к примеру, на территории Украины распространен только subsp. ucrainicum [3], тогда как в Литве – только типовой подвид subsp. ursinum [4].
Изучение внутривидовой неоднородности белорусских популяций Allium ursinum проводилось с использованием ISSR-маркеров. Данный тип нейтральных маркеров является одним из наиболее доступных, быстрых, воспроизводимых и не требующих использования флюоресцентных меток [5].
Цель данного исследования – оценить внутривидовой полиморфизм популяций Allium ursinum L. из различных географических локалитетов, на основании анализа морфологических и молекулярно-генетических маркеров, а также разработать подходы для создания научно обоснованной системы охраны черемши.
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования морфологических признаков послужили образцы черемши, собранные с юга, севера и центральной части Беларуси, а также образцы из гербариев БГУ, НАН РБ и коллекции (всего 100 образцов). Для молекулярно-генетических исследований было использовано 17 образцов черемши из различных географических локалитетов. Одним из основных морфологических критериев для анализа полиморфизма представителей A. ursinum являлось строение цветоножек. Для проведения молекулярно-генетических работ использовали тотальную ДНК, выделенную из свежего, замороженного или гербарного материала. Адаптация методик выделения ДНК проводилась во всех трех случаях.
Для ПЦР использовали 7 коммерческих декамерных праймеров, которые давали максимальное число фрагментов амплификации по результатам предварительных исследований. Нуклеотидная последовательность использованных праймеров, температура отжига и условия проведения ПЦР приведены в статье [6].
Результаты и их обсуждение. По результатам оценки морфологических признаков 100 образцов из различных популяций, вид Allium ursinum L. s. l. можно разделить на 3 группы. Первая группа исследуемых образцов характеризовалась наличием хорошо выраженных папилл на цветоножках (рис. 1а). Вторая группа отличалась голыми гладкими цветоножками, иногда с едва различимыми зачаточными папиллами (рис.1б). И наконец в третью группу вошли растения с промежуточным (intermediate) строением цветоножек, где степень выраженности и количество папилл варьировало в определенных пределах (рис 1в). Интересным оказался образец, привезенный из Франции (Commune Weinbourg), цветоножки которого имели наибольшее количество папилл на единицу площади, несравнимые ни с одним из образцов, собранных в Беларуси (рис.1г).
 |  |
 | |
| |
Рис. 1. Строение цветоножки черемши: А - с папиллами, Б - без папилл, В - промежуточная форма, с сильно выраженными папиллами (Commune Weinbourg) .
При оценке морфологического полиморфизма лука медвежьего, было отмечено, что образцы, собранные на юге и юго-востоке Беларуси, преимущественно имеют голые цветоножки, и принадлежат к подвиду Allium ursinum subsp. ucrainicum, занесенному в Красную Книгу Украины. Цветоножки экземпляров, произрастающих по северу и северо-западу страны, характеризуются хорошо выраженными папиллами, и относятся к подвиду Allium ursinum subsp. ursinum. На границе двух ареалов этих подвидов встречаются особи промежуточного типа, что может свидетельствовать о гибридности их происхождения.
На основании анализа полиморфизма ПЦР-продуктов были определены генетические дистанции по Nei, и проведен кластерный анализ по алгоритму Neighbor-Joining с помощью программы Treecon. Уровень полиморфизма ISSR-маркеров для образцов коллекции составлял от 37,5% до 100% (78,6%). Результаты кластерного анализа представлены на рис. 2.
Рис. 2. Кластерный анализ генотипов A. ursinum, принадлежащих разным популяциям. Длина ветвей соответсвует генетическим дистанциям по Nei, вероятность топологии дендрограммы подтверждена значениями bootstrap в узлах кластеров.
Как видно из рисунка 2, представители различных популяций образуют несколько кластеров, очевидными из которых являются кластер (ч5) - A. ursinum из Франции, Commune Weinbourg; кластер (ч2, ч3, ч4) – морфологический подвид Allium ursinum subsp. ursinum; и большой кластер (ч12, ч11, ч10, ч7, ч13, ч15, ч14), разделяющийся впоследствии на два кластера, где образцы ч14 и ч15 относятся к морфологическому подвиду Allium ursinum subsp. ucrainicum, а остальные образцы имеют промежуточные признаки двух подвидов. Данные молекулярно-генетического анализа коррелируют с морфологическими данными.
Заключение. Сравнительный анализ популяций Allium ursinum из различных географических локалитетов, показал, что на территории Беларуси встречаются 2 подвида лука медвежьего, а также гибридные формы на границах ареалов. Использование ISSR-маркеров позволяет выявить высокий уровень полиморфизма, который может служить основой для идентификации генотипов A. ursinum L. При высоких показателях внутривидового и внутрипопуляционного полиморфизма повышается количество возможных комбинаций генов, способствующих адаптации к окружающей среде. Поэтому следует рекомендовать к особой охране популяции с уникальным набором генетических маркеров, принадлежащие каждому из выявленных кластеров.
Работа по оценке молекулярно-генетического полиморфизма, а также по тестированию видовой обособленности неясных в систематическом отношении некоторых редких таксонов растений Беларуси с помощью ISSR-маркеров продолжается и поддержана грантом от БРФФИ .
Литература:
1. Интернет-адрес: http://redbook. minpriroda. /plantsinfo. html? id=125;
2. Stearn, W. T. Allium L. In: T. G. Tutin, V. H. Heywood, N. A. Burges, D. M. Moore, D. H. Valentine, S. M. Walters, D. A. Webb (eds.), Flora Europaea 5. Cambridge, 1980. – P. 49–69;
3. Червона книга України. Рослинний світ/ за ред. Я. П. Дідуха – К.: Глобалконсалтинг, 2009. – 900 с.;
4. Karpavičienė, B. Distribution of Allium ursinum L. in Lithuania / B. Karpavičienė // Acta Biol. Univ. daugavp. – 2006. – Vol. 6, N 1-2. – P.117 – 121;
5. Semagn K, Bjornstad, Ndjiondjop MN (2006). An overview of molecular markers for plants. African Journal of Biotechnology Vol. 5 (25): 2540-2568;
6. , , Хотылева ISSR-анализа для изучения внутри - и межвидового генетического полиморфизма различных таксонов высших растений. // Вестник БГУ, Сер. 2. 2013. № 3. С. 50 – 56.
