Методы защиты человека от воздействия приоритетных поллютантов (стр. 39 )

Полученную суспензию в смеси с фосфатным буфером (1:8 мл) поместить в кювету хемилюминесцентной установки. Для инициирования свечения в пробу ввести 1 мл 25 мМ раствора сернокислого железа.

При оценке наблюдаемой вспышки хемилюминесценции  выделить основные параметры:

h - высоту быстрой вспышки, зависящую от содержания в изучаемой системе гидроперекисей липидов;

Н - высоту медленной вспышки, отражающую способность липидов к перекисному окислению, максимальную интенсивность ПОЛ после введения Fe2+;

S - светосумму медленной вспышки, определяемую как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ею максимального значения, оценивающую число боковых цепей разветвления, т. е. сколько на 1 ион Fe2+ приходится образовавшихся перекисных радикалов (RООя);

tg б – тангенс угла наклона медленной вспышки, определяет скорость окисления липидов; ф – латентный период (в с) от момента введения железа (II) до достижения концентрации Fe2+ критической величины, латентный период зависит от соотношения в системе про - и антиоксидантов.

Критерии оценки (показатели в пределах нормы):

Спонтанная светимость 0,21 - 0,35 у. е.,

Вспышка 0,36 – 0, 50 у. е.,

Светосумма 1,70 - 2,70 у. е.,

Максимальная светимость 0,69 – 1,00 у. е.,

Наклон 0,18 – 0,32 у. е.

3.1.2 Метод оценки обеспеченности витаминами-антиоксидантами

Обеспеченность витаминами – антиоксидантами оценивается по концентрации витамина А и свободных токоферолов (витамина Е) в сыворотке крови флуориметрическим методом на анализаторе биожидкостей «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ» фирмы «Люмекс» (Россия). Обеспеченность витамином С в моче оценивали титриметрическим методом (по Тильмансу).

Определение массовой концентрации витамина А в сыворотке крови на анализаторе биожидкости «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ»

В две центрифужные пробирки помещается по 1 см3 дистиллированной воды и 1 см3 этанола. В первую поместить 1 см3 исследуемой сыворотки крови  (образец №2). Во вторую - 1 см3 дистиллированной воды (образец №1). Встряхивать (аппарат типа «Vortex») 30 сeкунд. Добавить 5 см3 гексана и встряхивать в течение 1 минуты. После встряхивания пробы центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой использовать для флуориметрического определения.

Массовую концентрацию витамина А (Х, мкг/см3) в сыворотке крови вычисляют по формуле:  , где

Сизм – концентрация витамина А в экстракте (мкг/см3);

Vэ – объем экстракта, см3;

Vc – объем сыворотки крови, взятой для анализа, см3;

Q –  коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Критерии оценки обеспеченности витамином А (показатели в пределах нормы):

0,3 – 0,7 мкг/см3

Определение массовой концентрации витамина Е в сыворотке крови на анализаторе биожидкости «ФЛУОРАТ-02 АБЛФ»

В две центрифужные пробирки помещается по 1 см3 дистиллированной воды и 1 см3 этанола. В первую поместить 1 см3 дистиллированной воды (образец №2). Во вторую - исследуемой сыворотки крови 1 см3 (образец №1). Встряхивать (аппарат типа «Vortex») 30 сeкунд. Добавить 5 см3 гексана и встряхивать в течение 1 минуты. После встряхивания пробы центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин. Четко отделившийся гексановый слой использовать для флуориметрического определения.

Массовую концентрацию витамина Е (Х, мкг/см3) в сыворотке крови вычисляют по формуле:  , где

Сизм – концентрация витамина Е в экстракте (мкг/см3);

Vэ – объем экстракта, см3;

Vc – объем сыворотки крови, взятой для анализа, см3;

Q –  коэффициент, учитывающий разбавление экстракта.

Коэффициент разбавления равен    ,

где Vк - объем разбавленного экстракта, см3;

V разб.- объем исходного экстракта, взятый для разбавления, см3.

Критерии оценки обеспеченности витамином Е (показатели в пределах нормы):

8 – 12 мкг/см3

Определение содержания витамина С в моче

Определение количества аскорбиновой кислоты в моче дает представление об обеспеченности этим витамином в организма.

Суточная экскреция витамина С с мочой здорового человека составляет 20-30 мг (или 113,55-170,33 мк моль/ сутки). Это количество снижается при острых и хронических инфекционных заболеваниях, особенно у детей.

Для определения обеспеченности витамином С в две конические колбы необходимо отмерить по 10 мл мочи, 10 мл дистиллированной воды и 1 мл (20 капель)  10%-го раствора соляной кислоты. Содержимое каждой колбочки перемешать и оттитровать 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндо-фенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.

Количество витамина С в моче рассчитывается по формуле:

где Х – количество аскорбиновой кислоты в моче  (в мг/сутки);

0,088 – коэффициент, отражающий количество аскорбиновой кислоты, эквивалентное  1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия  (в мг);

А – средняя арифметическая результатов титрования 0,001 н раствором краски Тильманса двух проб мочи (в мл);

В – среднее суточное количество мочи (для мужчин – 1500 мл, для женщин – 1200 мл);

Б  –  объем мочи, взятый для титрования (в мл).

Критерии оценки обеспеченности витамином С:

С мочой у  здорового человека экскретируется  20–30 м г витамина С и ли 1 13,55–170,33 мкмоль/сут.

3.1.3 Метод оценки ферментативной защиты по изменению активности ферментов супероксиддисмутазы и каталазы

Венозную кровь для определения антиоксидантных ферментов необходимо собрать в пробирки с антикоагулянтом, в качестве которого использовать ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислоту)  в количестве 1мг/мл.

Для определения активности антиоксидантных ферментов необходимо получить эритроцитарную массу путем трехкратного отмывания крови охлажденным (5°С) физиологическим раствором. Отделение эритроцитарной массы проводится  центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 10 минут. Из полученной эритроцитарной массы готовится на дистиллированной воде раствор гемолизата (1:100). Для полного гемолиза материал необходимо подвергнуть холодовому гемолизу.

В полученном гемолизате эритроцитов активность СОД определить с помощью наборов  «Randox» (Великобритания).

Критерии оценки активности СОД (показатели в пределах нормы):

176,00 – 196,00 U/г. Hb.

Для определения активности каталазы исходный гемолизат развести 0,067М Na, K-фосфатным буфером (1:100). Определение активности каталазы провести кинетическим спектрофотометрическим методом прямой регистрацией разложения субстрата фермента - перекиси водорода. За единицу активности каталазы принимают такое количество фермента, которое вызывает падение оптической плотности с 0,45 до 0,4 за 17 секунд.

Состав рабочего буфера: 0,067М фосфатный буфер рН 7,2, 0,01М перекись водорода. Активность выражают в единицах активности на 1 мг гемоглобина. Все измерения выполняются на спектрофотометре Genesys 5 (США), позволяющим снимать оптическую плотность в кинетическом режиме.

Критерии оценки активности каталазы (показатели в пределах нормы):

400 - 475 U/г. Hb.

3.1.4 Определение показателей липидного спектра и активность органоспецифических ферментов в сыворотки крови.

Определение общего холестерина в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом

В основе используемого метода лежит поэтапное ферментативное окисление ЭХС. Ферментативное определение протекает в несколько стадий. На первой стадии в результате ферментативного гидролиза эфиров холестерина (с участием холестеролэстразы) идет образование холестерина и высших жирных карбоновых кислот:

Эфиры холестерина + Н2О  холестеролэстераза +  холестерин + ЖК

На второй стадии образовавшийся холестерин окислятся растворенным в реакционной смеси кислородом воздуха в присутствии оксидазы ХС с образованием холест-4-ен-3-ен-она и Н2О2:

Холестерин + О2 – холестеролоксидаза  холест-4-ен-3-ен-он + Н2О2

Определение продуктов реакции (Н2О2) в процессе её протекания проходит по реакции Н2О2 с 4-Аминоантипирином в присутствии пероксидазы с образованием хинониминового красителя.

2Н2О2 + 4-ААР+ фенол – пероксидаза  хинониминовый краситель + 4Н2О

Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

В качестве исследуемого материала необходимо использовать сыворотку крови без следов гемолиза. Сыворотку крови в количестве 0,02 мл добавить к 2 мл рабочего реагента содержащего стандартный раствор ХС с концентрацией 35 ммоль/л, хлористый натрий 0,5 ммоль/л, фенол 28 ммоль/л, холестерол эстеразу > 0,1 Ед/мл, пероксидазу > 0,8 Ед/мл, 4-Аминоантипирин (4-ААР) 0,5 ммоль/л, перемешать и инкубировать не менее 15 минут при температуре 20-250С. Калибровочная проба необходимо приготовить  аналогичным образом, т. е. к 2 мл рабочего реагента добавить 0,02 мл калибратора. Контрольная проба не содержит сыворотки или калибратора, к 2 мл реагента нужно  добавить 0,02 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы измеряют в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длине волны 500 нм.

Для расчета содержания холестерина в исследуемом образце необходимо использовать  формулу:, ммоль/л

Для интерпретации полученных результатов анализа необходимо использовать  рекомендации ВОЗ.

Критерии оценки:  нормальные показатели – до 5,17 ммоль/л (200 мг/100 мл), пограничные показатели – от 5,17 – 6,50 ммоль/л (200 до 250 мг/100 мл), патологические показатели – свыше 6,50 ммоль/л (250 мг/100 мл).